实验动物金黄色葡萄球菌LAMP法快速检测

目的建立一种灵敏、高效,可用于实验动物金黄色葡萄球菌检测的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。方法针对金黄色葡萄球菌nuc基因(V01281.1)参考设计4条LAMP扩增引物,并选取常见实验动物致病菌进行引物特异性检测;通过优化LAMP反应体系中Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度及LAMP反应时间,确立LAMP反应最佳条件;本文采用LAMP法和PCR法对不同浓度梯度的金黄色葡萄球菌以及用不同浓度金黄色葡萄球菌人工感染的粪样进行检测,比较两种方法的检测灵敏度。结果通过条件优化,本实验建立的LAMP法检测实验动物金黄色葡萄球菌的最佳反应温度为60℃,反应时间为50 min,优化后的LAMP反应体系为dNTP浓度2.0 mmol/L、Mg~(2+)浓度8.0 mmol/L、引物对FIP/BIP浓度1.6μmol/L、引物对F3/B3浓度0.2μmol/L,且与其它常见实验动物致病菌无交叉反应;对金葡菌纯培养物进行检测,LAMP法检测灵敏度为9CFU/反应管(9×10~3CFU/mL),PCR法检测灵敏度为9×10~1CFU/反应管(9×10~4CFU/mL),对人工接种金黄色葡萄球菌的SD大鼠粪样进行检测,LAMP法检测灵敏度为4.49×10~4CFU/0.1 g粪样,PCR法检测灵敏度为4.49×10~5CFU/0.1 g粪样。结论本实验建立的实验动物金黄色葡萄球菌LAMP检测方法,与PCR法,免疫学法和传统检测方法比较,具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点,可应用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测。     

用LAMP法快速鉴别熟制牦牛肉饼中的猪肉和鸡肉成分

旨在建立一套LAMP体系对牦牛肉饼中掺杂的鸡肉和猪肉进行鉴定和检测.以牦牛、鸡和猪为研究对象,分别对牦牛的16S rRNA、鸡的12S rRNA和猪的12S rRNA-tRNA Val设计3组引物.通过模拟制作牦牛肉饼加工条件后,从肉饼中提取的DNA,进行LAMP扩增和电泳.结果表明,所设计的引物只能在对应的肉制品中扩增出目的条带,该法具有较高的特异性,可用于混合的生鲜牦牛肉或牦牛肉品中的动物源性成分的鉴定.将鸡肉和猪肉分别按一定的比例混合到牦牛肉中制成牦牛肉饼,采用建立的LAMP体系对其进行掺杂检测,鸡肉的检出限为0.25%,猪肉的检出限为0.125%.该方法在肉品的鉴别上具有简单、快速和特异性强的特点,在为熟肉制品种类来源的检测提供了新方法.     

罗非鱼无乳链球菌LAMP快速检测方法的建立

针对无乳链球菌高度保守的表面免疫相关蛋白基因,采用环介导等温扩增技术(LAMP),设计4条特异性引物,优化反应体系,建立罗非鱼无乳链球菌快速诊断方法.研究结果表明,LAMP方法检测灵敏度达到30 CFU·m L-1,且对2株罗非鱼源无乳链球菌均能扩增出特异性片段,而对14株非无乳链球菌均未扩增出相应片段.建立的LAMP检测方法具有高度的特异性和灵敏性,反应在1 h内完成,为罗非鱼无乳链球菌病的快速诊断提供了一种重要的技术手段.     

基于Omp25基因和环介导等温扩增技术检测布鲁氏菌方法的建立

目的建立灵敏、特异、快速的LAMP检测布鲁氏菌的方法。方法基于布鲁氏菌保守的Omp25序列设计了4套引物,根据文献合成了基于此序列的3套引物,利用7套引物建立了检测方法;应用浊度法和电泳法对4种布鲁氏菌进行检测,确定最佳引物;通过对4种布鲁氏菌和其它17种常见菌同时进行检测评价方法的特异性;通过对不同稀释浓度的4种布鲁氏菌的DNA进行LAMP检测以确定方法的灵敏度。结果本研究新设计的一套引物被确定为最佳引物;用建立的LAMP法对17种常见菌株进行扩增,结果均为阴性,本方法具有很高的特异性;LAMP法检测猪种S2、羊种M5、牛种104 M和布鲁氏菌犬种55226四种布鲁氏菌DNA的灵敏度分别为5×10-4、5×10-5、5×10-3ng/μL和5×10-4ng/μL;检测反应在30 min以内完成。结论本方法具有快速、灵敏、特异的特点,有望成为快速检测布鲁氏菌的有效手段。     

鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100—109拷贝),最低检测限度为4拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。     

食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

食品及其原料中沙门氏菌的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义.根据沙门氏菌invA基因核苷酸序列设计一组引物,应用环介导等温扩增技术（LAMP）,分别对7种不同血清型沙门氏菌和4种非沙门氏菌进行扩增,同时建立沙门氏菌人工污染的食品模型,比较了LAMP法与活菌计数检测的敏感性.结果表明,该方法仅对沙门氏菌产生特异性扩增,灵敏度高达336,mL-1,食品样品经细菌富集培养后,检测灵敏度高达8.25,g-1.所建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性,操作简单、快速,可用于沙门氏菌污染食品的快速检测.     

鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 快速检测方法的建立与应用研究

摘要: 目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA 基因设计特异性引物和探针,构建含有HA 基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN 线性范围达10 个数量级( 100—109 拷贝) ,最低检测限度为4 拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCＲ 和测序进行确证。整个检测过程可在2 h 内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。     

3种松材线虫分子检测技术的比较分析

分别用特异性引物法、ITS-PCR-RFLP法和实时荧光PCR法对松材线虫进行了检测,通过检测时间、检测精度和操作情况等方面的比较得出:特异性引物PCR法操作简便、成本低,是目前的常规检测技术;ITS-PCR-PFLP法可以鉴定到小种,相比特异性引物法更具说服力,但耗时较多,适用于线虫种群分化研究和种类鉴定,而不适合作为一种快速检测技术;实时荧光PCR法耗时短,灵敏度高,操作简便安全,只是仪器设备要求较高,适合松材线虫的口岸检验检疫工作.     

食品中单增李氏菌实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污染的可能性，在对26种病原菌进行检测过程中，运用实时荧光PCR法和经典培养法进行比较，结果表明用实时荧光PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌，更快速、敏感、特异性更高。     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立一种简便、快速、灵敏、特异的副猪嗜血杆菌(Hps)检测方法,以Hps的16S rRNA保守区域片段为靶序列,选择6个特异性区域,设计4条特异性引物F3、B3、FIP和BIP。经优化反应体系、检测灵敏性和特异性,建立Hps的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。研究结果表明:该方法的最优反应体系是引物c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP)为1∶4、Mg~(2+)浓度为2 mmol/L、d NTPs浓度为6 mmol/L,最低检出量为0.241pg/μL DNA。该方法灵敏度是PCR法的100倍,且能够特异性检测出Hps,不能检测出猪链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和金黄色葡萄球菌。     

单核细胞增生李斯特菌三种检测方法的比较

目的:通过比较国标法、real-time PCR法和LAMP方法,得到适合基层实验室快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法。方法:分别用国标法、real-time PCR法和环介导的等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测李斯特菌,并进行方法比较。结果:三种方法对单增李斯特菌的检测结果一致.国标法整个检测过程需5~7 d;real-time PCR法实验条件要求高,成本高,检测需1.5~2.5 d;LAMP法实验条件低,成本低,检测时限与real-time PCR相同。结论:LAMP法检测单增李斯特菌灵敏度高、特异性强、快速高效和低成本,适合基层实验室应急检测和现场监测使用。     

重金属汞、镉离子快速检测方法建立及应用

采用荧光微球分别标记抗重金属汞、镉离子小鼠多克隆抗体,牛血清蛋白偶联EDTA螯合的重金属汞离子、镉离子包被硝酸纤维素膜,制成的荧光快速检测试纸,应用层析式竞争法检测水样中的重金属离子.重金属汞离子荧光检测试纸检测重金属汞离子的灵敏度为5.5 ng/mL,检测限为0.03 ng/mL,重金属镉离子荧光检测试纸检测重金属镉离子的灵敏度为0.51 ng/mL,检测限为0.04 ng/mL,与其余金属离子的交叉反应率低.所建立的方法操作简单,快速,灵敏度高,特异性好,可作为水样中重金属残留筛查的有效手段.     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

猕猴桃褪绿环斑相关病毒RT-LAMP-LFD可视化检测方法的建立

猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspot-associated virus, AcCRaV)是侵染猕猴桃的主要病毒之一.为实现对猕猴桃中AcCRaV的快速检测和监控,本研究建立了一种逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)结合横向流动试纸条(LFD)的检测方法,可实现快速、可视化检测猕猴桃中AcCRaV.本研究基于AcCRaV外壳蛋白基因保守区域,设计了一套LAMP特异性引物,优化后的反应体系在62℃恒温条件下,反应60 min,再进行5 min试纸条显色反应,即可完成样品的检测.检测灵敏性实验结果表明,建立的RT-LAMP-LFD方法具有较高的灵敏性,其检测灵敏度是常规RT-PCR的100倍.二者检测结果一致,LFD试纸条实现了检测结果的可视化.总之,该检测方法可为检测猕猴桃中AcCRaV感染状况提供了一种省时、高效的诊断方法.     

荧光定量PCR技术及其在动物病毒病定量检测中的应用

荧光定量PCR技术是一种核酸定量技术,该技术在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.该技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,因此在动物病毒病的检测中,荧光定量PCR技术不但能定量检测病原体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵敏、快速、省力的特点.     

实时荧光PCR技术检测致敏原小麦的研究

采用实时荧光PCR技术检测致敏原小麦成分.试验结果表明:采用小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的特异性检测引物和探针进行检测时,26种样品经实时PCR扩增,只有小麦产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号.灵敏度试验结果表明:该方法对小麦致敏原基因的检测灵敏度较高,可达到1 mg.kg-1,符合痕量检测要求.     

建立一种快速鉴定大西洋鳕鱼及其制品的SYBR Green荧光PCR方法

通过大西洋鳕鱼CoxI序列的比对分析,在序列的差异处设计了大西洋鳕鱼的特异性引物,建立了一种大西洋鳕鱼SYBR Green荧光PCR定性检测方法,并进行了引物特异性和灵敏度分析.结果表明:检测的大西洋鳕鱼样品和49份其他动、植物样品DNA中,只有大西洋鳕鱼样本出现显著扩增,6次平行反应的Ct值为23.216±0.113,5份大西洋鳕鱼同属鳕鱼样品和44种常见其他动、植样品均无明显扩增曲线.模拟样品灵敏度检测实验显示,该特异性引物可用于检测质量分数为0.01%的大西洋鳕鱼肉粉,灵敏度可达0.06ng/μL.通过对市售鳕鱼片检测的验证,该方法特异性强,灵敏度高,可用于食品中大西洋鳕鱼成分真实性的鉴别.     

大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确的大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定方法.方法:根据GenBank中大黄鱼、小黄鱼线粒体中ND6基因的序列,设计并合成特异性引物和cycling探针,以草鱼为阴性对照,进行实时荧光PCR反应.结果:利用设计合成的大黄鱼和小黄鱼特异性引物和cycling探针进行实时荧光PCR反应,大黄鱼和小黄鱼均产生特异扩增曲线,对照的草鱼没有产生扩增曲线.结论:利用设计的引物和cycling探针,可准确快速鉴定大黄鱼和小黄鱼.     

基于布鲁氏菌omp25基因的环介导等温技术建立及初步应用

为了建立布鲁氏菌环介导等温技术(LAMP),并应用于基层布病诊断,本实验针对布鲁氏菌外膜蛋白基因Omp25区域设计6条引物,用SYBR Green I染料做指示剂,65℃反应60 min,85℃5 min终止,根据SYBR Green I颜色变化判定结果,用普通PCR验证LAMP检测技术的灵敏度和准确性,并对临床疑似布病病料进行检测验证其临床检测意义。结果显示:LAMP检测的灵敏度为4.2 fg/μL布鲁氏菌基因组DNA,比普通PCR高100倍左右;其特异性较好,能够准确检测布鲁氏菌,琼脂糖凝胶电泳显示阳性结果均为梯形条带,而大肠杆菌、卡介苗、金黄色葡萄球菌、李氏杆菌等均为阴性;对新疆4个地区25份绵羊流产胎儿病料进行LAMP和普通PCR方法平行检测,其符合率为100%。结论:LAMP检测技术用于布病临床诊断具有快速、高效、便捷等特点,为基层布病的病原学诊断具有潜在的实用价值。