无血清微载体培养MDCK细胞和甲型流感病毒H1N1的条件优化

 血清微载体培养MDCK细胞,并接种流感病毒H1N1,优化培养条件,为细胞流感疫苗的工艺研发奠定基础.采用不同的细胞接种量在50mL无血清微载体搅拌瓶中培养MDCK细胞,并接种甲型流感病毒H1N1,检测不同pH值和TPCK-胰酶含量的病毒培养液,不同病毒接种量,补加TPCK-胰酶,以及不同收毒时间对血凝效价的影响.以1.0×10⁵mL^-1的MDCK细胞数量接种到无血清微载体上,病毒培养液pH值为7.2~7.4范围内,TPCK-胰酶质量浓度为1.0μg/mL,接种后不补加胰酶,病毒接种量MOI=1.0,并在72h收获,最高血凝效价达到512.由此获得了在无血清为载体上培养MDCK细胞和甲型流感病毒H1N1的适宜条件.     

不同细胞工厂培养Vero细胞增殖效果

为建立细胞工厂筛选方法,比较市售三个厂家(Corning、Thermo、兰州百灵)细胞工厂培养Vero细胞的生长增殖情况.通过Vero细胞光学显微镜观察、生长曲线、贴壁率、流感病毒增殖对比指标,比较三个厂家细胞工厂培养Vero细胞增殖效果.结果显示,光学显微镜观察三个不同来源的细胞工厂培养的Vero细胞形态变化无明显生长差别,连续传代培养Vero细胞,细胞生长良好.三种不同细胞工厂均能较好促进细胞的生长增殖且细胞生长曲线均呈“S”型;贴壁率分别为(86.20±0.62)%、(94.50±0.70)%、(89.53±0.60)%.甲型H5N1流感病毒感染细胞48 h后,出现明显细胞病变,且血凝效价HA为1∶16,感染性滴度为2.5.三个不同来源的细胞工厂均能支持Vero细胞培养及甲型H5N1流感病毒的增殖,可为细胞工厂筛选提供参考.     

KMB17细胞培养流感病毒的实验研究

 探讨了流感病毒在KMB₁₇细胞上培养的可行性.将3株不同型别的流感病毒(A/Wisconsin/67/2005H3N2,A/New Caledonia/20/1999 H1N1和B/Malaysia/2506/2004)分别接种于KMB₁₇细胞上,在无血清的条件下于不同pH值和不同胰酶浓度的维持液中35℃培养72 h后收获病毒,测定血凝效价.实验结果表明,所用的3个毒株中的H3N2亚型毒株(A/Wisconsin/67/2005 H3N2)血凝效价明显高于另外的H1N1亚型(A/NewCaledonia/20/1999 H1N1)和B型(B/Malaysia/2506/2004)毒株.因此认为KMB₁₇细胞可作为培养流感病毒的备选培养基质.     

牛轮状病毒的分离与细胞培养特性

探讨牛轮状病毒(BRV)的细胞培养方法,为研发诊断试剂盒和疫苗提供依据.将RT-PCR阳性样品在MA-104细胞及Vero细胞上进行培养,盲传4代后MA-104细胞出现病变(CPE),主要表现为细胞脱落,出现拉网现象,部分出现死亡.这表明轮状病毒能够在MA-104细胞上生长,并引起细胞病变;而Vero细胞无病变.用胰酶处理的病毒接种MA-104细胞,用含2μg/mL、3μg/mL和5μg/mL三种(A、B和C)不同浓度胰酶的培养液在MA-104和Vero细胞对犊牛轮状病毒传代培养.将分离培养的病毒经聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明BRV在C组培养液中分离培养最好,聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示病毒核酸呈4∶2∶3∶2排列,与参考株NCDV相似,呈典型A群轮状病毒的特征.     

中药大青叶有效单体抗流感病毒作用

采用中药大青叶有效单体进行体外抗流感病毒(H1N1)的研究,通过观察病毒引起的细胞病变效应(CPE)、 MTT法检测细胞活性,红细胞凝集实验检测病毒血凝滴度,考核药物的抗病毒作用.结果表明:大青叶有效单体1#, 2#, 3#, 4#对流感病毒无直接灭活作用,也不能阻止流感病毒的吸附,而能抑制流感病毒在MDCK细胞内的的生物合成.其半数抑制浓度(IC50)分别为30.80, 29.74, 27.56, 25.85 mg/L,治疗指数(TI) 分别为6.33, 9.30, 10.77, 15.05. 其抗流感病毒效果优于病毒唑(IC50=101.05 mg/L, TI =5.25),和抗病毒口服液(IC50=104.41 mg/L, TI=5.03), P<0.01.在160 mg/L时能抑制流感病毒在MDCK细胞内的增殖达90 %左右.在40～160 mg/L内大青叶1#, 2#, 3#, 4#单体能明显降低流感病毒血凝滴度(P<0.05).大青叶有效单体1#, 2#, 3#, 4#能安全高效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.     

TritonX-100裂解流感病毒的研究

 在流感病毒高浓度条件下,寻找TritonX-100裂解流感病毒的适宜条件.在不同条件下用TritonX-100裂解WHO推荐用2007～2008年度流感病毒疫苗毒株制备的3个亚型的流感病毒,用电镜观察裂解程度,通过蔗糖密度梯度离心纯化抗原后免疫动物,以检测疫苗的免疫效果.结果表明当流感病毒的血凝效价是1:16382,裂解时间为24h时,TritonX-100在质量分数为1%可以完全地裂解B型,质量分数达到2%才可以完全裂解流感病毒H1N1和H3N2,这说明TritonX-100对A,B亚型毒株的裂解效果不同.由于每年都要更换毒株工人生产新的流感疫苗,因此应该对使用TritonX-100的裂解不同亚型的流感病毒条件进行研究,以保证裂解疫苗的质量.     

猪轮状病毒的细胞培养

在猴肾传代细胞系（MA－104）上成功培养了猪的轮状病毒。病毒接种前用胰酶处理且维持液中不含血清，连续传代后出现明显的细胞病变（CPE）：细胞先肿大变圆，边界不清，后聚集、萎缩，直到死亡脱落。     

实验用近交系小型猪WZSP表皮干细胞建系的初步研究

目的将五指山猪(Wuzhi Shan Pigs,WZSP)表皮干细胞传至15代以上,初步建立实验用近交系小型猪WZSP表皮干细胞系。方法采集WZSP耳组织,通过中性蛋白酶消化获得表皮细胞,再通过0.25%胰酶 0.02?TA消化制成单个表皮细胞悬液,接种在Ⅳ型胶原包被的培养瓶内,采用无血清条件培养基培养,0.25%胰酶消化传代。对所培养表皮干细胞进行AKP染色鉴定。结果表皮干细胞能够快速粘附在Ⅳ型胶原上,呈克隆状生长,已传至15代以上,传代间隔为7 d左右;取第5代细胞进行AKP染色呈阳性。结论在本实验条件下,建立ESCs细胞系是可能的,经鉴定,所培养细胞具有干细胞基本特性。     

猪流行性腹泻病毒变异株的分离鉴定及其S基因序列分析

为分析山东省2016年上半年猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株变异情况,用Vero细胞从仔猪临床腹泻样品中进行病毒分离,通过细胞病变(CPE)观察、聚合酶链式反应(PCR)方法、免疫荧光(IFA)试验、电镜观察、动物回归试验和测序分析,分离鉴定1株PEDV毒株(SDMY1401株).将该毒株进行S基因序列分析和遗传进化分析,结果表明该毒株为PEDV流行变异株.该毒株S基因核苷酸序列与山东省分离株CH-SDZC-2015和河南省分离株CHHNAY-2015同源性最高为99.4%,与疫苗毒株CV777同源性为94%.遗传进化分析表明该毒株与经典毒株DR13、疫苗毒株CV777及以前国内分离毒株在不同分支.     

郴州市2006年流行性感冒监测结果分析

目的探讨进一步做好流感的网络监测工作。方法采集流感样病例（ILI）的鼻咽拭子标本用狗肾传代（MDCK）细胞进行流感病毒分离，用红细胞血凝抑制试验（ILI）进行流感病毒型别鉴定。，结果全年4所监测哨点医院共报告流感样病例（ILI）3288例，占该监测门诊就诊人数的1.61％；每月均有ILI报告，以6～8月为发病高峰；共采集并检测ILI鼻咽拭子标本665份，分离到流感病毒株40株（6.02％），经分型鉴定A（H1N1）亚型35株，B型5株。ILI暴发疫情3起，共采集并检测ILI鼻咽拭子标本29份，分离到B型流感病毒株18株（62.07％）.结论2006年郴州市全年均有流感流行，流行的优势毒株是A（H1N1）亚型和B型毒株。     

通过载体表达siRNAs抑制禽流感病毒复制的研究

禽流感病毒是养禽业危害最严重的病原微生物之一。为探讨小干涉RNA(siRNA)对A型禽流感病毒复制的干扰作用,以H5亚型AIV PB2基因为靶序列,设计合成了4对编码siRNAs的DNA序列,将其克隆到psiRNA-hH1neo载体中,构建siRNAs表达载体,鉴定正确后将重组质粒转染MDCK细胞,采用G418筛选建立抗性细胞系,用血凝(HA)试验和real time RT-PCR试验检测抑制效果, 在细胞水平筛选出具有高效抑制AIV复制的2个靶位点PB2-1154、PB2-342、为AIV的基因功能研究,抗病毒药物的开发和转基因动物的研究奠定了基础。     

重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及EGFP表达水平研究

研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平，可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据．本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR—EGFP同时感染不同的哺乳动物细胞株，利用流式细胞仪检测EGFP的表达强度．共使用20种哺乳动物细胞株，其中10种人类组织细胞，2种猴组织细胞。8种小鼠组织细胞．结果表明，重组痘苗病毒wR-EGFP对鼠细胞系BHK21和人细胞系A-549的感染效率和表达效率最佳；整体看，痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞；对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞；但没有特别的组织偏嗜性。     

Epstein-Barr virus transforms precursor B cells even before immunoglobulin gene rearrangements

The very early stages of the human B-cell differentiation pathway are poorly understood, primarily because of the lack of appropriate permanent cell lines. Epstein-Barr virus (EBV) is a putative human oncogenic virus which transforms human B cells in vitro into continuously proliferating cells. It has been believed that EBV transforms mature B cells, but recently, transformation of immature pre-B-cell lines has been reported, suggesting that EBV might also transform cells much earlier in the B-cell lineage. We report here the establishment of cell lines transformed by EBV at various stages of the B-cell differentiation pathway. Interestingly, two lines showed the complete absence of immunoglobulin synthesis and the lack of immunoglobulin gene rearrangement despite containing EBV genome and surface markers of B cells. Our results indicate that EBV can infect and transform cells of the B lymphocyte lineage even before immunoglobulin gene rearrangement.     

Study on the purification of OPV produced on vero cells with Q-Sepharose F. F.

Q-Sepharose Fast Flow (Q-Sepharose F. F.) was adopted to purify the suspensions of type I, II, III oral poliovaccine (OPV), which is prepared from Vero cells. After clarification and concentration by ultrafiltration, the recovery of virus infected titre may attain above 85%. Using column chromatography on Q-Sepharose F. F. to purify the concentrated virus suspensions, the purified viruses attain 100% recovery of virus infectivity. Dot membrane hybrization was used to detect DNA with the probe of Vero cell genome DNA which was labeled with α-P³² dATP, the contents of residual substrate DNA was less than 100 Pg/dose. The process of downstream had no significant influence on some biological characters of purified viruses, such as virus morphology, tumorigenicity, rct/40 character and capsid protein. This downstream reseach indicates that Q-Sepharose F. F. is an ideal chromatography material for purifying OPV prepared from Vero cells. Biography: LIAO Guo-yang (1962-), Ph D Candidate.     

心肌宁冲剂体外抗柯萨奇B_3病毒的试验研究

本试验采用细胞培养方法,检测心肌宁药物对感染CB_3病毒的心肌细胞和Vero细胞的保护作用。结果表明该药可明显阻止CB_3病毒吸附细胞表面、进入细胞及产生直接的灭活作用;明显降低培养细胞的病变程度,对Vero细胞和心肌细胞具有明显的保护作用,其保护率分别为87.4％和90.2％,对感染的心肌细胞,心肌宁明显减弱病毒的毒力,其作用呈良好的量效关系。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养

目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养。方法取BALB/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对MEF的生长形态进行观察,并对传代细胞培养液、胚胎胎龄、胰蛋白酶浓度进行筛选。结果 MEF在体外为贴壁生长型细胞,第三、四、五代细胞纯度较高且增殖最为旺盛;添加血清的M199和DMEM均能较好的满足原代细胞的生长,两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异;11.5～16.5d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;0.1%胰蛋白酶消化MEF时间以8～11min为宜。结论通过对MEF分离培养影响因素的筛选,为MEF的进一步研究奠定了基础。     

腈水合酶产生菌 Rhodococcus sp.HUST-1发酵条件的优化

Rhodococcus sp.HUST-1在Co2+的诱导下产腈水合酶,催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺.对菌株HUST-1的产酶条件进行优化.研究表明,发酵过程中培养基中的碳氮源、诱导剂浓度以及培养条件影响腈水合酶的高效表达.在葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、Co2+0.08 mmol/L、酪氨酸0.2 g/L、pH7.0、培养温度28℃时,HUST-1所产腈水合酶总酶活达1 012.7 U,比优化前提高了47.1%.