MTMR14稳定敲减细胞株的建立及表型分析

目的: 为了解析芽殖酵母 Num1 蛋白在纺锤体定位和线粒体中的调节机制．方法: 利用大肠杆菌原核表达 并纯化了在 Num1 功能中起核心作用的补丁组装(PA) 结构域的重组蛋白, 通过蛋白体外结合实验(Pull-down) 分 离了酵母细胞中与 PA 结构域相结合的蛋白复合物,并对其进行了质谱分析．结果: 鉴定了一系列新的 Num1 互作蛋 白,包括核糖体蛋白,参与蛋白折叠、分配及转运的内质网和高尔基复合体蛋白, 参与基因转录和翻译的核酸酶和 蛋白酶,及其他功能的蛋白．结论: Num1 的互作蛋白的鉴定为进一步研究 Num1 的作用机制奠定了基础．     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

利用CRISPR/Cas9方法敲除CBFβ基因及CBFβ真核表达载体的构建

构建CBFβ敲除Hep G2细胞系及CBFβ真核表达载体。CRISPR/Cas9基因敲除,将表达CBFβsgRNA,Cas9的表达载体共转Hep G2细胞,嘌呤霉素筛选基因敲除细胞,构建细胞系。infusion cloning方法构建CBFβ表达载体,Hep G2细胞提取RNA,反转成c DNA,设计CBFβ引物扩增目的基因,连接,转化,挑取阳性克隆,PCR鉴定,酶切鉴定,测序进一步鉴定。获得了稳定敲除CBFβ的Hep G2细胞系及在Hep G2细胞中稳定表达的CBFβ真核表达载体。为研究CBFβ基因在对乙型肝炎病毒复制的调控及调控机制奠定了基础。     

孤独谱系障碍相关基因dialr斑马鱼突变体的构建及行为学表型探析

dialr基因是人类孤独症谱系障碍相关基因.临床研究发现,缺失diaJr可能会导致患者面部畸形、智力障碍和语言发育迟缓等症状.目前,对dialr基因的功能及分子机制知之甚少,仅有少数在鸡胚、斑马鱼、小鼠中的表达定位研究.本文通过CRISPR/Cas9系统构建了dialr敲除的斑马鱼突变体模型,成功获得了稳定遗传的纯合突...     

p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器质量及血液学参数测定

摘要: 目的测定自主建立的p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器及血液生理生化指标,并比较周龄、性别对各项指标的影响。方法选取4 周龄和8 周龄的p53+ /－ 基因敲除小鼠各20 只,雌雄各半,测定其主要脏器质量及血液生理指标。结果不同周龄和性别的p53+ /－ 基因敲除小鼠部分脏器质量和血生理生化有差异性。4 周龄和8 周龄小鼠在体质量等这21 项指标上都有差异显著性( P ＜ 0. 01) ,且在左肾上腺等8 项指标上差异存在统计学意义( P ＜ 0. 05) 。4 周龄的雌、雄小鼠在ＲDW、总胆固醇( CHO) 这2 项指标上差异存在显著性( P ＜ 0. 01) ,仅肺这1 项指标上差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) ,其余指标之间无明显差异; 而8 周龄雌雄小鼠在体质量等16 项指标上雌雄间都有显著性差异( P ＜ 0. 01) ,在HCT 等9 项指标上存在差异( P ＜ 0. 05) 。结论本文测定并比较了不同周龄及性别的p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器及血液生理生化指标,为该模型的合理利用及商业化供应提供了背景数据。     

B6-Trp53tm1 /NIFDC 小鼠在MNU 给药后的体质量、脏器质量、血液学及血生化指标的测定

摘要: 目的测定自主建立的p53 + / － 基因敲除小鼠( B6-Trp53tm1 /NIFDC) 在N-甲基-N-亚硝基脲( N-Methyl-Nnitrosourea,MNU) 给药后体质量、脏器质量、血液学及血生化指标,为临床前药物安全评价致癌性实验短期体内替代试验候选遗传修饰动物模型提供背景性数据。方法共设计4 个组: 阴性对照组( 野生型小鼠) 给予生理盐水、溶媒对照组( B6-Trp53tm1 /NIFDC 小鼠) 给予枸橼酸缓冲液、MNU 组1 ( B6-Trp53tm1 /NIFDC 小鼠) 给予75 mg /kg MNU、MNU 组2( 野生型小鼠) 给予75 mg /kg MNU,阴性对照组和MNU 组2 每组野生型小鼠各20 只,雌雄各半,溶媒对照组和MNU 组1 每组B6-Trp53tm1 /NIFDC 小鼠各20 只,雌雄各半,测定其体质量、主要脏器质量、相对脏器质量、血液学及血生化指标,并进行统计分析。结果MNU 组1、MNU 组2 动物体质量降低与阴性对照组、溶媒对照 组相比都存在显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) 。MNU 组1、MNU 组2 动物心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胸腺和颌下腺的绝对质量与阴性对照组、溶媒对照组相比有显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) 。MNU 组1 和MNU 组2 动物心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺和颌下腺的相对质量与阴性对照组、溶媒对照组相比有显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) 。MNU 组1 和MNU 组2 动物均发现NEU、LYM%、LUC%、ＲBC、HGB、HCT、MCV、MCHC、ＲDW、HDW、CHCM、CHDW、PDW、MPV 及PLT 等15 个指标与阴性对照组和溶媒对照组相比有显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) 。另外,MNU 组1 和MNU 组2 均发现TP、ALB、CＲEA、UＲEA、TCHO、TG、CA 等7 个指标与阴性对照组和溶媒对照组有显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) ,MNU 组2 的AST 与阴性对照组和溶媒对照组有显著性升高( P ＜ 0. 05) ,但MNU 组1 和MNU 组2 组间没有显著性统计学差异。结论本文测定并分析了自主建立的p53 + / － 基因敲除小鼠( B6-Trp53tm1 /NIFDC) 和野生型小鼠分别给予MNU 及枸橼酸缓冲液后的体质量、脏器质量、血液学及血生化指标,该模型有望将来用于临床前药物安全评价致癌性实验短期体内替代试验。     

抗条纹叶枯病基因qSTV11~(KAS)新分子标记建立及23种香型水稻qSTV11~(KAS)基因的调查分析

根据抗条纹叶枯病品种"秀水123"与易感品种"日本晴"抗条纹叶枯病基因qSTV11~(KAS)在距离起始密码子第一个脱氧核苷酸+640处的差异,建立了一种能够更便于区分qSTV11~(KAS)基因型的CAPS(BtgⅠ)分子标记及检测方法,并对23种香型水稻的qSTV11~(KAS)基因进行调查分析.结果表明,CAPS(BtgⅠ)分子标记可以用来区别水稻是否含有抗条纹叶枯病基因qSTV11~(KAS)及基因型;在检测的23种香稻中,仅有"中香1号"、"青香软粳"和"泰国香稻"3种水稻含有与"秀水123"相同的qSTV11~(KAS)抗性基因.本研究为今后分子标记辅助选育抗条纹叶枯病香型水稻新品种和筛选条纹叶枯病新的抗性基因资源应用奠定了基础.     

心血管疾病的基因治疗

基因治疗在先天遗传性以及后天获得性心血管疾病治疗中均具有广阔的发展前景. 对心血管疾病致病机理的深入认识和疾病基因组学研究的发展, 进一步促进了临床前基因治疗的研究进展. 但基因治疗过程中存在的机体细胞免疫反应、外源基因表达水平不足、在体基因转导效率低下等因素都成为基因治疗临床应用转化的瓶颈. 近年来, 基因导入载体和基因组编辑技术的发展为上述问题的改善和解决提供了新的思路. 目前成族规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas9 基因组编辑技术已经成功应用于动物模型的在体基因编辑, 达到了显著改善血脂指标的疗效. 进一步研究体内组织特异和高效的基因导入方式, 提高基因编辑的靶向效率和特异性, 并建立全面有效的安全评估实验体系, 将推动基因治疗向临床应用的转化. 针对心血管疾病基因治疗中基因导入载体的研究以及CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的应用展开讨论.     

中国疾病预防控制中心实验动物从业人员岗位培训机制的研究

摘要: 通过对中国疾病预防控制中心实验动物从业人员现状调查,分析实验动物从业人员培训中存在的问题,建立和完善适合本中心实验动物从业人员岗位培训机制。重视从业人员上岗培训和人才队伍的建设,提高实验动物人才队伍专业素质和专业技术水平,促进实验动物工作的快速发展。     

小鼠巨细胞病毒PCR 诊断方法的建立及其应用

摘要: 目的建立小鼠巨细胞病毒( MCMV) PCR 检测方法,并进行初步应用。方法根据NCBI 公布的巨细胞病毒设计引物,进行PCR 体系优化、敏感性、特异性测试; 运用优化后的方法,对87 份小鼠血清进行检测,对阳性样本进行测序分析。结果建立的小鼠巨细胞病毒PCR 方法灵敏度高,特异性好,初步检测4 个屏障设施的87 份小鼠血清, 13 份为阳性,通过测序证实为小鼠巨细胞病毒,验证了此方法的可行性。结论为小鼠巨细胞病毒的快速检测提供了方法。     

线栓法制备大鼠脑缺血模型的研究进展与思路

摘要: 线栓法在脑缺血再灌注模型的制备中应用广泛,但影响其成功率的因素有很多种,本文意于寻求一种更加有效的模型制作方法。通过查找大量文献,对相关文献进行归纳和总结。在对缺血性脑血管疾病的研究过程中,脑缺血实验动物模型为非常重要的研究途径,而在模型制作过程中大鼠的选择、麻醉药品使用、栓线的使用和手术方法等都是影响模型能否成功的关键要素。本文便是对线栓法制作大鼠局部脑缺血动物模型的方法和特点作一综述及介绍。     

小鼠肝肿瘤细胞原位灌注分离培养方法的建立

摘要: 目的建立一种有效分离小鼠肝肿瘤细胞的原代培养方法,为肝癌发生发展的机制研究提供有效的实验手段。方法以9 月龄H-ras12V 转基因肝癌小鼠为实验材料,采用传统的小鼠肝细胞原代培养的灌注分离法,并对其进行改进,即在灌注的同时,用剪刀剪去肿瘤表面阻塞的血管和组织,疏通灌注液流,达到有效消化肿瘤组织的目的。对用此改良灌注法分离的肝肿瘤细胞和肿瘤周围组织细胞进行成活率计数,并进行后续的原代细胞培养,观察第3、5、7 天的细胞生长状态和形态特征。结果通过对传统的灌注分离肝细胞法进行改良,分离的肝肿瘤细胞成活率由未改良前的10%提升到40%。原代培养的结果表明,分离的肝肿瘤细胞与肝肿瘤周围的正常肝细胞的形态和随时间延长的凋亡变化状态没有显著差异。结论改良的灌注法能够有效的分离小鼠肝肿瘤细胞,并显著提高其存活率和细胞质量,可用于后续的原代细胞培养并开展相关的实验。另外,本文对改良灌注法的详细叙述也为相关的科研工作者提供了切实可行的操作规程。     

多种沙门氏菌分离培养基效果比较及在实验动物和垫料检测中的应用

摘要: 目的改进实验动物沙门氏菌分离培养方法,建立垫料中沙门氏菌检测方法。方法参考国内外沙门氏菌检测方法,用不同分离培养基对沙门氏菌、大肠杆菌和变形杆菌进行培养。选用最佳筛选效果培养基对动物肠道和垫料样品进行检测。结果BPW 预增菌、MKTTn 选择性增菌转种XLT4 培养基分离沙门氏菌的效果优于其他培养基,在1015 份动物样品中检测出3 份沙门氏菌阳性,能够检测出垫料中1CFU/g 的沙门氏菌。结论改进的沙门氏菌分离培养方法检出率高于现有国标方法,结果准确,可用于实验动物沙门氏菌及垫料的检测。     

福建省实验动物从业人员培训基地建设的实践与设想

摘要: 开展实验动物从业人员培训是提高“实验动物标准化”和“动物实验规范化”的出发点和落脚点。本项目针对我省前期培训条件薄弱与覆盖面有限的缺憾,结合外省市成功经验,借鉴驾照与职称等考试的理念,筹建并申报了“福建省实验动物从业人员培训基地”,建立了“岗位证书”培训考试系统; 编写了不同对象的培训教材和教学大纲; 举办了4 期实验动物从业人员培训班、1021 人获得“岗位证书”; 探索分析了培训基地建设与实践的经验和不足,为我省以后开展实验动物从业人员培训奠定了基础。     

医用输液、注射器和卤化丁基胶塞的溶血性测定

摘要: 目的通过测定河北省内生产、销售或正在使用的医用输液器、注射器具和注射用卤化丁基胶塞的溶血性,以评价其生物安全性。方法依据国标,采用体外静态直接接触溶血法,以实验兔心脏血为材料,分别测定了一次性输液器、一次性无菌注射器和注射用卤化丁基胶塞各10 批样品的溶血率,并对该3 类产品体外溶血程度进行了比较。结果所测样品的溶血率均＜ 5%。结论所测样品的溶血性均符合相关产品标准的规定,表明该3 类产品在溶血方面具有一定的生物安全性。     

Further support for a Cretaceous age for the feathered-dinosaur beds of Liaoning, China: New 40Ar/39Ar dating of the Yixian and Tuchengzi

We report new ⁴⁰Ar/³⁹Ar dating results obtained from total fusion and incremental-heating analyses of sanidine and biotite from three tuffs found interbedded within the fossil-bearing deposits of Liaoning, northeast China. The first is a new sample of the Bed 6 Sihetun tuff from the Yixian Formation, previously dated by our team as middle Early Cretaceous, and recently considered by Lo et al., partially reset due to metamorphism from a nearby basaltic sill. The second is the Yixian Bed 9 tuff from Hengdaozi considered by Lo et al. to be unaffected by metamorphism and whose age, based on total fusion ⁴⁰Ar/³⁹Ar dating of biotite, argues for a Jurassic age for the Yixian Formation. The third tuff is a previously undated tuff from the upper part of the underlying Tuchengzi Formation. Single crystal total fusion ⁴⁰Ar/³⁹Ar analyses of the Sihetun sanidine showed homogeneous radiogenic Ar, Ca/K ratios, excellent reproducibility and gave a mean age of 125.0 ± 0.18 (1SD) ± 0.04 (SE) Ma. Single sanidine crystal total fusion ⁴⁰Ar/³⁹Ar analyses of the Hengdaozi tuff gave a mean age of 125.0 ± 0.19 (1SD) ± 0.04 (SE) Ma, which is indistinguishable from the Sihetun tuff. The Tuchengzi Formation tuff gave a mean age of 139.4 ± 0.19 (1SD) ± 0.05 (SE) Ma. Detailed laser incremental-heating analyses of biotite from Sihetun, Hengdaozi, and Tuchengzi tuffs show disturbed Ar release patterns and evidence of trapped argon components. We conclude from these analyses that the total fusion dates on biotite by Lo et al. are erroneously old and isotopic dating of both biotite and sanidine from tuffs of the Yixian Formation point to a middle Early Cretaceous age. The upper part of the Tuchengzi Formation can be referred to the Early Cretaceous.