副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立一种简便、快速、灵敏、特异的副猪嗜血杆菌(Hps)检测方法,以Hps的16S rRNA保守区域片段为靶序列,选择6个特异性区域,设计4条特异性引物F3、B3、FIP和BIP。经优化反应体系、检测灵敏性和特异性,建立Hps的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。研究结果表明:该方法的最优反应体系是引物c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP)为1∶4、Mg~(2+)浓度为2 mmol/L、d NTPs浓度为6 mmol/L,最低检出量为0.241pg/μL DNA。该方法灵敏度是PCR法的100倍,且能够特异性检测出Hps,不能检测出猪链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和金黄色葡萄球菌。     

奶牛乳房炎病原菌的分离和PCR方法快速鉴定

奶牛乳房炎是奶牛养殖场中最严重的疾病之一.为了确定奶牛乳房炎主要致病菌,本实验对采自养殖场临床乳房炎40个病例的乳样,用传统细菌培养方法分离奶牛乳房炎病原菌进行形态学鉴定;用纯化培养后细菌单菌落提取DNA作为模板,利用已报道的细菌通用引物,采用PCR方法进行分子鉴定.结果共分离得到10种主要致病菌,它们是嗜酸氧化硫硫杆菌,琼氏不动杆菌,农杆菌,蜡状芽孢杆菌,地衣芽胞杆菌,芽孢杆菌,大肠杆菌,克雷伯菌,假单胞菌,金黄色葡萄球菌.本研究成功建立了一种快速、特异性强的奶牛乳房炎致病菌的鉴定方法.     

枯草芽孢杆菌TY7210菌株的ERIC-PCR快速鉴别

以ER IC核心序列为引物,以2株枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,采用PCR对T aq DNA聚合酶用量、PCR退火温度及模板DNA浓度进行优化,建立了快速鉴别芽孢杆菌的ER IC-PCR方法,并对5株芽孢杆菌进行了分析.结果表明枯草芽孢杆菌TY 7210菌株与其他芽孢杆菌菌株具有不同的指纹图谱,尤其不同于枯草芽孢杆菌(ATCC 1.1849),为芽孢杆菌的快速鉴别奠定了基础.     

角蛋白酶基因kerB的提取、 克隆及表达

从角蛋白酶产生菌株地衣芽孢杆菌L-25中提取基因组DNA， 借助特定引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到kerB基因片段. 扩增后的kerB片段通过分子生物学方法克隆 到产酶缺陷型枯草芽孢杆菌DB104菌株敏感细胞中进行表达. 结果表明， 表达成功的FD-8菌 株（DB104/pLK18）可以在羽毛培养基上生长并完全水解羽毛.     

浓香型大曲中多株芽孢杆菌的分离及鉴定

采用传统微生物分离方法从浓香型白酒大曲中筛选出8株优势芽孢杆菌,通过形态特征观察并结合细菌脂肪酸鉴定技术(MIDI鉴定系统)对其进行鉴定。结果表明,从大曲中分离筛选得到8株芽孢杆菌分属于5个种,分别为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。     

Bacillus sp.XJ1-05菌株GbsA基因的克隆及其生物信息学分析

根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC 14580的GbsA基因(GeneID:3027576)的核甘酸序列设计1对特异性引物.通过PCR的方法扩增由本实验室分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsA基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,结果表明得到的GbsA基因的开放阅读框(ORF)全长为1473bp.在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:其与Bacillus licheniformis ATCC 14580的GbsA基因的氨基酸序列同源性高达97%.生物信息学分析表明:该GbsA基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个醛脱氢酶作用位点.     

地衣芽孢杆菌TG116诱导黄瓜抗病性相关防御酶系的研究

为了探讨地衣芽孢杆菌TG116诱导黄瓜抗病性机理,研究其对黄瓜叶片防御酶活性的影响.采用比色法测定了地衣芽孢杆菌TG116诱导黄瓜根部后对叶片中多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等3种防御酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响.结果显示,经地衣芽孢杆菌TG116灌根处理后,黄瓜叶片中的POD、PPO、PAL等防御酶类活性升高,MDA含量略有下降并达到新的平衡;经黄瓜枯萎病病原菌灌根处理后,黄瓜叶片中的POD、PPO、PAL等防御酶活性及MDA含量迅速上升;尤其同时接种TG116和黄瓜枯萎病病原菌后,3种防御酶类活性上升的幅度比单独接种要高,同时黄瓜叶片中MDA含量比单独接种黄瓜枯萎病病原菌有所降低,减轻植株细胞膜脂过氧化损伤.研究表明,地衣芽孢杆菌TG116在一定程度上能够诱导黄瓜的系统抗病性.     

地衣芽孢杆菌DY-1溶磷条件的研究

利用单因子试验及正交试验优化了地衣芽孢杆菌DY-1的最佳溶磷条件,并用钼锑抗比色法测定了菌株的溶磷能力.试验结果表明,以1%葡萄糖为碳源,0.1%硫酸铵为氮源时地衣芽孢杆菌DY-1溶磷量最大.最佳溶磷条件为:温度30℃,pH 8.0,培养时间72 h,3%接种量.     

新疆艾比湖中度嗜盐菌A6的16SrDNA分析

从新疆艾比湖分离得到中度嗜盐菌A6,该菌能够在0%~20%NaCl的条件下生长,为有芽孢的杆状菌。采用真细菌16SrDNA通用引物PCR扩增A6菌株的16SrDNA,得到的片段长度为1512bp。使用NCBI~Blast软件在Gen-bank数据库中对其进行同源性检索,A6的16SrDNA序列与多种地衣芽孢杆菌16SrDNA序列同源性高达99%。使用MEGA3.1软件构建系统发育树,A6菌株与地衣芽孢杆菌的亲缘关系最近。由此判断A6菌株属于芽胞杆菌属。结合生理生化分析及对A6菌株的甜菜碱醛脱氢酶基因和Ⅲ型乙醇脱氢酶基因的序列同源性分析,初步确定A6菌株有可能是地衣芽胞杆菌的1个新种。     

地衣芽孢杆菌营养要求的研究

本文报道了地衣芽孢杆菌的营养要求,结果表明,以葡萄糖为碳源,多种氨基酸为氮源,地衣芽孢杆菌的最佳C/N为4～4．51。满足该菌对维生素H和必须氨基酸的需要以及主要无机盐的需要时,其菌数最高为(3．55～6．7)×107/ml,可使菌数是对照的2．1～3．5倍。     

中度嗜盐菌GbsB基因的克隆、序列分析及生物信息学分析

为构建耐盐的转基因植物提供材料,根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisATCC 14580的GbsB基因的核甘酸序列设计1对特异性引物,通过PCR的方法扩增由分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsB基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,采用NCBI-BlastX软件在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:得到的GbsB基因的开放阅读框(ORF)全长为1209bp,编码1个由402个氨基酸残基组成的蛋白质;其与Bacillus licheni-formisATCC 14580的GbsB基因的氨基酸序列同源性高达96%。生物信息学分析表明:该GbsB基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个乙醇脱氢酶作用位点。     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

一株高温菌所产酶的功能分析与菌株分类鉴定

从长白山温泉中分离出一株可产生淀粉降解酶的高温菌(CW₂), 用薄层层析法分析鉴定酶促淀粉降解的产物, 发现CW₂所产生的淀粉降解酶系胞外酶, 可催化淀粉降解产生异麦芽低聚糖(主要包括异麦芽糖、 异麦芽三糖和潘糖). 用PCR法扩增其16S rDNA, 测定其序列（873 bp）, 与GeneBank中已知菌的16S rDNA序列对 比, 该菌株与模式菌株Bacillus licheniformis ATCC 14580,Bacillus licheniformis  DSM 13,Bacillus subtilis strain JM4的16S rDNA序列同源性最高, 只分别相差9,9,13个碱基, 序列相似性分别为98.97％,98.97％,98.51％. 用Neighbor joining方法构建CW₂进化树, 并用Bootstraping法对其评估, 结果表明, CW₂与Bacillus licheniformis, Bacillus sonorensiss形成Bacillus属中的亲缘关系最近的一个进化种群.     

地衣芽孢杆菌1.934培养条件的优化

研究了生物肥功能菌——地衣芽胞杆菌1.934 (Bacillus licheniformis)培养条件对菌体生长量的影响.采用了单因素实验和响应曲面法(RSM)设计实验和分析数据.获得了菌体摇瓶培养的最适条件:培养温度35℃,转速为150r/min,接种量为3.6％,pH为7.5.地衣芽孢杆菌在最适条件下培养约20h,淀粉酶的酶活最高,活力可达12.7U/mL培养液.培养约27h得到最大的菌体收益.     

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶分离纯化研究

对产白地表茅孢杆菌(B.licheniformis)的碱性蛋白酶通过乙醇沉淀、盐析、DEAE阴离子交换层析,凝胶层析4步纯化.以酶比活力为指标,对碱性蛋白酶分离纯化条件进行了优化.结果发现:提纯酶的比活力达62098U/mg,纯化倍数为23.7,活性回收率为15.7%.     

高产杆菌肽菌株的筛选及培养条件研究

采用细胞融合技术得到的菌株与不同来源地衣芽孢杆菌菌株,进行深层液体发酵生产杆菌肽,研究了不同菌株,不同碳源,不同量锌和磷量诸因素对杆菌肽高产的影响.结果表明,1号菌比B-1号、B-2号、3号、4号株菌的效价高,为5.80×102Iu.mL-1.以柠檬酸为碳源时,磷的用量为0.10~0.20 mmol.L-1的最佳培养基中培养时,最有利于杆菌肽的合成,锌的用量10%,其发酵液中杆菌肽效价最高,可达8.86×102~9.85×102Iu.mL-1.     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

普洱茶渥堆发酵过程中嗜热细菌的分离和鉴定

对普洱茶发酵全过程的茶样进行了pH检测,发现在渥堆过程中pH在前期有所下降达到4.5,中期基本趋于稳定,后期又有所回升。根据渥堆过程中高温和偏酸性的特征,采用传统培养与分子生物学方法相结合,对全过程的茶样在高温条件下进行细菌的分离、纯化及鉴定。结果发 现有大量嗜热细菌的存在,包括凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans,枯草芽孢杆菌 Bacillus- subtilis,地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis,热嗜淀粉芽孢杆菌 Bacillus thermoamylovorans,Bacillus shackletoni,喜热噬油芽胞杆菌 Geobacillus thermoleovorans,乳酸片球菌 Pediococcus acidilactici,植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum,等。这些嗜热细菌和嗜热真菌一起在普洱茶的发酵中起到了关键作用。     

外源有机碳浓度对藻菌关系及氮磷去除的影响

采用实验室一次培养法,以葡萄糖为有机碳源,对地衣芽孢杆菌和丝藻进行单独及混合培养,研究了外源有机碳浓度对藻菌相互关系及氮磷去除效率的影响。结果表明,当水体中葡萄糖质量浓度不高于20mg/L时,地衣芽孢杆菌能显著促进丝藻的生长。尤其当葡萄糖质量浓度为20mg/L时,藻菌体系叶绿素荧光强度最大可达5227,较纯丝藻体系相应值提高约15%;当葡萄糖质量浓度为50 mg/L时,藻菌体系对水体中NH_4~+-N和PO_4~(3-)-P的去除率分别达到27%和60%,显著高于纯丝藻及纯菌体系相应值;当葡萄糖质量浓度高于50mg/L时,藻菌体系和纯丝藻体系对氮磷的去除率无显著差异;当葡萄糖质量浓度高于100mg/L时,地衣芽孢杆菌明显抑制丝藻的生长。     

敖古拉中高温油田微生物驱油可行性分析

为改善中高温油田高含水期的开发效果,针对敖古拉油田塔3井区开展了微生物驱油技术的可行性分析。依据微生物驱油的地质基础及筛选标准,敖古拉油田的地质参数和油水物性满足微生物驱油的基本条件。室内评价了2株菌Bacil-lus licheniformis TY1和Bacillus subtilis TY2的乳化性能、驱油性能和配伍性。降蜡率在10%～25%,降胶率在15%～25%,降低原油黏度50%以上。天然岩心驱油实验提高采收率5-9个百分点,具备实施微生物驱油技术的应用潜力。