培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响

研究了基因工程菌P ich ia p astotis高密度、高表达的培养条件。在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、(NH4)2SO4及磷酸盐浓度等因素对猪胰岛素前体(P IP)表达的影响。研究表明:甲醇的最佳诱导浓度为6 g/L,过高或过低的甲醇浓度都不利于菌体生长和蛋白表达;在菌体生长和蛋白表达阶段,pH应分别控制在5.5和4.0;诱导阶段,培养温度下降到28°C,可以提高重组蛋白质的表达量。上述结果用于15 L全自动发酵罐实验,P IP表达水平达到了1.69 g/L,是摇瓶结果的17倍。     

培养温度对多拷贝毕赤酵母猪胰岛素前体的分泌表达和生理特性影响(英文)

研究了培养温度对多拷贝毕赤酵母分泌表达猪胰岛素前体(PIP)的生理特性的影响。将多拷贝重组菌A2(12拷贝)和A3(18拷贝)分别在25℃和30℃培养,25℃培养时PIP表达水平分别比30℃培养时提高了40%和32%,而A3细胞的存活率提高了20%。对A3细胞内相关蛋白折叠和氧化程度的KAR2,PDI1,GLR和TRR1基因转录水平分析发现,相比30℃培养25℃培养时减少了16%~35%,这表明多拷贝重组A3菌株在低温培养时比高温培养在蛋白折叠和氧化协廹响应有明显的减缓效应,从而导致外源蛋白表达提高了40%。     

毕赤酵母表达人胰岛素前体的纯化和N末端不均一性分析

利用毕赤酵母生产人胰岛素前体时,在胰岛素前体的N末端引入一段由lO个氨基酸组成的间隔肽(EEAEAEAEPK)虽然可以提高目的产物的表达量,但间隔肽中的多个酶切位点有可能造成目的产物N末端的不均一性。对毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体蛋白进行分离纯化,得到的样品经过MALDI-TOF-MS和N末端测序,证实了胰岛素前体N末端不均一性的现象,并对产生不均一性的原因进行了分析。实验同时证实,利用毕赤酵母得到的胰岛素前体,经胰蛋白酶酶切后,生成了B链缺少第30位苏氨酸但N末端均一的胰岛素产物desB30,且C末端未发生降解,这为人胰岛素和地特胰岛素的制备提供了新思路。     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

表达胰岛素的毕赤酵母生长动力学及诱导策略

对本实验室构建的一株重组巴斯德毕赤酵母基因工程菌的生长及诱导进行了研究,结果表明生长阶段菌体的生长与限制性基质甘油残留浓度的关系符合Monod关系式,细胞最大生长比速率为0.204h^-1,饱和常数为24.3g/L。经参数推导得理论最大细胞对甘油得率为0.497g/g,以及菌体生长维持系数为0.007g/g·h,后者说明此株工程菌有高密度发酵的潜力。诱导阶段补加酵母提取物、大豆蛋白胨和微量元素能有效提高目的蛋白产量。在发酵罐上罐试验中,目的蛋白产量达256mg/L,蛋白产量是摇瓶发酵蛋白产量的5倍多。     

毕赤酵母表达猪胃蛋白酶的研究

利用已有的猪胃蛋白酶原A cDNA,构建毕赤酵母pPIC3．5K—pA胞内表达载体．经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得2株高表达的重组子,并研究了在不同pH、不同诱导时间、不同起始浓度和甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低．结果表明：在pH7、诱导72h、起始诱导浓度为OD600为2、甲醇诱导浓度为1％时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6．46U／mL．     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.     

毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白的研究

本试验将能够成功表达重组人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后，流加亚硒酸钠，同时设空白对照发酵液(不加入亚硒酸钠)，通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量，判断硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重组蛋白质中。发酵液经热处理、超滤、离子交换和丙酮沉淀等步骤后，进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、X射线能量色散谱(EDX)和原子吸收分析。结果表明，加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2%，硒与蛋白质的质量比为0.0069，高于对照发酵液近35倍，初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化，转化为硒代氨基酸，并形成硒代重组蛋白质。     

毕赤酵母表达重组植酸酶酶学性质的比较研究

通过酶学性质比较毕赤酵母GS115表达的E.coli K12植酸酶(appA)及其突变体植酸酶(appA NR)和黑曲霉植酸酶(phyA)的最适pH、温度、热稳定性及对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性.结果表明,在95℃,加热10 min,appA NR可残余90％左右的活力,而其他两种只残余20％～50％的活力;appAN...     

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.     

基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌Pichia pastoris的发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时，接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为20左右时，细胞生长的延迟期约为2.11h，细胞生长光密度与培养时间的关系模型为：y=0.7841e^0.2319t（线性相关系数r=0.9936）；在补料发酵时细胞浓度可达115g/L-160g/L（干重），在120h重组人血清白蛋白表达量达3.6g/L。     

基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白

通过响应曲面法(RSM)优化巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6表达高亲水性重组人源胶原蛋白的摇瓶培养条件。采用Box-Behnken设计(BBD)考察初始诱导pH值、温度和甲醇添加量三个主要影响因子对重组人源胶原蛋白表达量的影响,利用DX7Trial软件设计实验方案,根据该方案设置不同培养条件进行实验并测定相关参数。响应面分析确定的最优因素水平组合为:初始诱导pH值为5.0,诱导温度为28℃,甲醇添加量为2.2%/24 h。通过响应面法优化发酵的内在因素水平,找出最佳条件,为利用其指导在发酵罐中进行高密度发酵生产人源胶原蛋白奠定基础。     

重组毕氏酵母发酵过程的结构模型

分析了毕氏酵母（Pichia pastoris)以甘油和甲醇为碳源时的代谢途径，建立了胞内物质流和能量流的平衡方程－结构模型。经过适当的降维，解得比碳源消耗速率，比氧消耗速率，比乙酰辅酶A生成速率，细胞比生长速率等关键反应速率。结合反应器模型获得操作变量与过程状态变量间的关系。用实验数据对模型进行了初步验证。结果表明，该模型能较准确地描述细胞生长和重组蛋白合成过程。     

重组Pichia酵母(Muts)发酵过渡阶段关键酶活分析

重组Pichia酵母表达系统的发酵存在从利用甘油为碳源生长到利用甲醇为碳源表达外源蛋白的发酵表达过渡阶段。Pichia酵母过渡阶段碳源代谢途径关键酶酶活分析表明：甲醇诱导3h AOX2酶活为0,4h时突然增加到0．05U,继续诱导,酶活缓慢增加;在过渡阶段甲醛脱氢酶和6-P-葡萄糖脱氢酶分别增加了6．1倍、2．5倍,而丙酮酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶分别下降为原酶活的29．4％及16．4％,表明甲醇诱导后甲醇完全氧化代谢途径得到强化,而糖酵解途径和三羧酸循环途径代谢作用减弱。     

基因工程菌Pichia pastoris连续培养的生长及抑制动力学

在同一稀释率μ（μ＝0．14h^-1）下用不同浓度的甘油流加进行连续培养,研究甘油浓度对基因工程菌毕赤酵母（Pichia pastori）生长的影响。结果表明甘油浓度对细胞生物量（DCW和WCW）、底物得率系数（Yx/s）、底物比消耗速率（qs）、呼吸熵（RQ）与二氧化碳释放率（CER）都有影响,在低甘油残留浓度（＜63．3g／L）下,甘油是激活剂,菌体生长符合Monod方程,Ks＝19．62g／L,甘油激活常数Ka＝19．45g／L;而在高甘油残留浓度（＞63．3g/L）下甘油是抑制剂,菌体生长特征符合Haldance方程,Ks＝0．014g／L,K1=156．67g／L。毕赤酵母生长的甘油抑制浓度为55．2g／L。     

Cloning and Expression of Recombinant Human Thymosin in Yeast Pichia pastoris

The gene of human thyrnosin alpha 1 (hT(1)was synthesised according to favorite eodons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24Ethat is N-aeetylserine were replaced by hT( 1 for the constitution of hT(1-RP fusion gene in order to express acetyllated thyrnosin α1. And also, the Asn-Gly bond was designed to faeiliate isolation of the target protein. The fusion gene was cloned into the expression vector, pPIC/gK. The constructs were transformed into HIS4 mutant strain GS115 by eleetroporation. Both SDS-PAGE analysis and Western blot analysis indicated that the fusion protein was expressed successfully.     

重组人骨形态发生蛋白4在毕赤酵母中的表达研究

试图建立人骨形态发生蛋白-4在毕赤酵母(Pichia pastoris) 中的表达技术.包括:将hBMP4成熟片段从全长cDNA亚克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达rhBMP4的载体质粒pPIC9K-hBmp4.经转化Pichia pastoris宿主菌株GS115,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达上清液经SDS-PAGE和Western-blot 分析,结果表明rhBMP4以单体形式分泌到发酵上清液中,单体分子质量大小约为26 ku,摇瓶表达量达到20.13 μg/mL.     

重组人胰岛素及C肽的分离纯化

对基因工程构建的含重组人胰岛素和C肽基因的毕赤酵母工程菌进行诱导表达，工程菌用甲醇诱导72 h后，离心去除菌体，上清液经中空纤维膜超滤后SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析，0~400 mmol/L NaCl梯度洗脱，得到纯度大于92％的重组人胰岛素原。经Lys-C酶和羧肽酶B酶切后，Sephadex G-25柱分离，得到了重组人胰岛素和C肽。