利用酵母双杂交系统筛选与BnSmD1相互作用的蛋白

本研究以油菜BnSmD1为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术,从甘蓝型油菜cDNA文库中筛选出与之有相互作用的Arf-GTP酶激活蛋白1(Brassica napus ADP-ribosylation factor GTPase activating protein1,BnArf GAP1),采用RT-PCR扩增并克隆到3个油菜Arf GAP基因的开放阅读框全长序列,BnArf GAP1、BnArf GAP2和BnArf GAP3.BnArf GAP1和BnArf GAP2都拥有1个507bp的开放阅读框,编码168个氨基酸残基;与前两个基因相比,BnArf GAP3核苷酸序列中插入了一个93bp的带有终止密码子的外源片段,导致翻译的提前终止,它拥有1个249bp的开放阅读框,编码82个氨基酸残基.BnArf GAP1和BnArf GAP2核苷酸序列一致性达到98.22％;BnArfGAP1与BnArf GAP3核苷酸序列一致性达到82.83％,BnArf GAP2与BnArf GAP3核苷酸序列一致性达到84.17％.BnArf GAP1、BnArf GAP2和BnArf GAP3都含有一个C2结构域.     

利用泛素分裂系统筛选AtTR1相互作用蛋白质

以AtTR1作为诱饵蛋白利用泛素分裂系统在拟南芥cDNA文库中筛选与拟南芥AtTR1基因相互作用的蛋白质.运用营养缺陷型培养基和X-Gal显色、PCR扩增及酶切分析等实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和比对.通过泛素分裂系统筛选到可靠的AtTR1相互作用蛋白质,测序比对后,选取HMA与AtTR1通过GST pull-down进行进一步的验证,结果证明它们确实存在相互作用,这对进一步研究AtTR1及其相互作用蛋白质在植物耐热中的作用和耐热分子机制奠定了基础.     

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用. 结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3). 免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用. NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.     

酵母双杂交筛选血液中与PERIOD1相互作用的新蛋白

采用酵母双杂交方法,以人PER1的PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选能与之相互作用的蛋白.经酶切和核苷酸序列测定,证实重组诱饵载体hper1PAS/pGBKT7构建成功.血cDNA文库转化效率为1.4×106/3μg pGADT7-Rec.酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.     

应用酵母双杂交系统筛选与Spr2相互作用的蛋白

Spr2在斑马鱼胚胎发育过程中的中胚层和外胚层中表达,它可以通过调控Fgf信号通路来调控斑马鱼中胚层的发生.为了进一步揭示Spr2调控Fgf信号通路的分子机制,本文通过酵母双杂交系统在斑马鱼早期胚胎cDNA文库中筛选可能与Spr2相互作用的蛋白,以酵母融合的方法在6.3×106个转化子中筛选到78个阳性克隆,测序鉴定后最终得到Pairedboxgene6a、mSin3A-associatedprotein130等11种可能与Spr2蛋白相互作用的蛋白,通过结果分析推测Spr2可能通过fgf8参与Fgf信号通路的调控.     

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.     

利用酵母双杂交技术筛选与CCDC58相互作用的蛋白

卷曲螺旋是存在于多种天然蛋白质中的一种结构域,涉及调节基因表达,膜融合以及细胞分裂等多种重要的生物学功能.CCDC58是一种由人体宿主细胞编码的蛋白质,含有卷曲螺旋结构域,由144个氨基酸组成,编码CCDC58的基因定位于人类3号染色体上.目前对该蛋白的研究不是很多,它的具体作用机制及相关的互作蛋白并不清楚.本实验通过酵母双杂交技术,以CCDC58作为诱饵,在cDNA文库中寻找与CCDC58相互作用的蛋白,最后通过反向验证筛选出5个可能有相互作用的蛋白.为了在体外进一步确认这种相互作用,本实验通过GST Pull-down实验,最终确认TP53BP2和CCDC58具有很强的相互作用.     

利用酵母双杂交系统筛选IrrE相互作用蛋白

本研究通过酵母双杂交技术,构建了IrrE蛋白为诱饵载体,从拟南芥cDNA文库中筛选与IrrE诱饵蛋白相互作用的功能蛋白.研究结果表明,在所获得的阳性克隆中,发现了一个与拟南芥基因At1g01470所编码的蛋白有较高同源性的蛋白,即LEA14蛋白（晚期胚胎发育富集蛋白）,同源性高达98%.推测IrrE转录因子在提高植物耐盐性的过程中起了重要作用.     

应用酵母双杂交技术筛选与p53相互作用的蛋白质

应用酵母双杂交技术筛选与p53发生相互作用的蛋白质,有助于进一步阐明其在肿瘤发生、发展中发挥重要作用的调控机制。采用酵母双杂交技术,以p53C末端（62-393aa）作为诱饵筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质．并运用报告基因等实验提供的信息,经过重复验证排除假阳性以确定最后的阳性克隆。以p53C末端（62～393aa）作为诱饵最终筛选出了一个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这一个阳性克隆为：PIAS3（Protein inhibitor of activated stat3）。说明了PIAS3蛋白能与p53（62-393aa）发生特异性的相互作用。     

酵母双杂交技术的发展

自酵母双杂交系统创建以来，已经成为研究蛋白质相互作用的重要手段，被广泛用于各个生物学研究领域，揭示了大量未知蛋白质之间的相互作用。近年，在经典的酵母双杂交系统基础上，针对其局限性，相继提出许多新的研究方法，如：双（多）筛选法，SOS富集系统，哺乳动物细胞双杂交系统，三杂交系统，单杂交系统，逆向双杂交系统，等等。本将对上述方法进行详细叙述。酵母双杂交及其衍生系统已经成功地运用于蛋白质之间，蛋白质与DNA、PNA、配体之间的相互作用的研究。     

酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子elF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor 3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子elF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

酵母双杂交技术筛选与Axin相互作用的蛋白质

肿瘤抑制因子Axin以构架蛋白的形式通过Wnt、JNK、p53、TGF-β、G蛋白等众多信号转导途径参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种重要细胞命运的调控过程.为了发现Axin新的相互作用蛋白,进一步研究Axin的多功能性,作者通过酵母双杂交技术,将Axin1基因从SpeI单一酶切位点到3′末端的DNA序列构建到pGBKT7载体作为诱饵,对小鼠脑的cDNA文库进行筛选,最后获得28个阳性克隆.通过对这些克隆的测序和对所得序列的生物信息学分析,得到13个与Axin的C末端相互作用的蛋白质,这些蛋白主要参与胚胎发育,肿瘤形成,蛋白翻译后修饰等生物学过程的调节.这一结果为进一步研究Axin的新功能提供了很好的线索.     

酵母双杂交系统的改进和发展

酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法，具有快速和高效的特点，但也存在一些局限性．人们针对它的缺点相应地进行了一些完善和改进，并衍生出单杂交系统、三杂交系统等一系列相关的技术，从而拓宽了该系统的应用领域．     

以酵母双杂交系统筛选与糖基转移酶相互作用的蛋白质

用N－乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅲ（GNTⅢ）β1,4－半乳糖基转移酶Ⅱ（GTⅡ）作诱饵,以酵母双杂交系统分别从胎肝cDNA文库中筛选到一种能与GNTⅡ发生相互作用的蛋白质,筛选到两种能与GNTⅢ发生相互作用的蛋白质。与Ⅲ作用的是早幼粒细胞白血病锌指蛋白（PLZF）,属于视黄酸受体家族的一种转录因子。提出了一种新的相互作用假设模型：PLZF是GNTⅢ的底物之一。另发现纤粘蛋白（FN）与GTⅡ作用,并推测此相互作用参与了细胞粘附。以上两种相互作用都是已知蛋白间的未知相互作用。还发现GTⅡ与由新基因编码的蛋白相互作用。     

与拟南芥TR1相互作用的蛋白质筛选和鉴定

TR1是一个定位于质膜上的E3连接酶,前期的研究表明它可赋予多种植物对盐、干旱和热胁迫的耐受性。但是,其发挥功能的分子机制尚不清楚,与其存在相互作用的靶蛋白也未找到。本研究利用酵母双杂交系统以AtTR1-△119为诱饵蛋白筛选拟南芥归一化通用型cDNA文库,结果获得了13个与其有潜在互作的候选蛋白。经酵母正向和反向多次验证发现转化了TR1与CURT1C和TR1与SWEET5的酵母在三缺和四缺培养基中均正常生长,而且在含有X-α-gal的培养基中出现蓝斑。双分子荧光互补技术证明TR1与CURT1C和SWEET5之间也有相互作用,这对进一步研究AtTR1及其相互作用蛋白质在植物抗逆中的作用和分子机制奠定了基础。     

酵母双杂交筛选与视黄醇结合蛋白有相互作用的蛋白质

为了研究视黄醇结合蛋白(RBP)在维生素A代谢调控中的作用和与相关疾病发生、发展的关系,以RBP作为诱饵基因构建了融合表达载体pGBKT7-RBP;在排除自身转录激活活性的基础上,与人肾脏cDNA预转库融合筛选(Pretransformed MATCHMAKER Lbraries),经营养缺陷型和X-α-gal显色鉴定,从中筛选出三种与RBP有相互作用的新蛋白质,并从人睾丸cDNA库中克隆了这三个基因的全长序列。     

酵母双杂交筛选与脱落酸受体相互作用的蛋白质及其重转酵母的验证

脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,它能使植物适应逆境胁迫,从而调节植物的生长发育状况.现今ABA受体已被公认为RCARs/PYR/PYLs家族蛋白.本实验通过拟南芥为模式植物,利用酵母双杂交系统共转化方法从拟南芥cDNA文库中筛选与RCAR3相互作用的蛋白质,获得多个阳性克隆,从中选取一个与生长素调节相关的基因NIT1的全长cDNA重新转化酵母验证,发现与RCAR3仍然有相互作用,排除了假阳性的可能.从而为下一步研究该基因与RCAR3的相互关系做好了准备.     

用酵母双杂交系统筛选与PEN-2蛋白胞内端相互作用的蛋白

γ-分泌酶复合体对β-淀粉蛋白前体蛋白(Beta-amyloid precursor protein,βAPP)的水解是生成β-淀粉蛋白(Aβ)的关键步骤,在阿尔茨海默氏症(Alzhei mer′s disease,AD)的病理发生中起着重要作用.PEN-2蛋白(Presenilin enhancerprotein 2)是γ-分泌酶的一个重要组分,在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色.此外,PEN-2还具有促进神经细胞存活和防止细胞凋亡的作用.为了进一步研究PEN-2的生理功能,以PEN-2为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白,发现PCBP4和GRK5肽段可结合PEN-2,并在酵母体系用β-半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用.这些结果表明PCBP4和GRK5可能影响PEN-2的正常生理功能,并且有可能在阿尔茨海默氏症的形成中起着一定的作用.     

酵母双杂交系统的研究进展

酵母双杂交系统自创建以来,已成为研究蛋白质相互作用的重要手段,揭示了大量未知蛋白质之间的相互作用。随着该系统的广泛应用,近年来又发展了三杂交系统、单杂交系统、逆向双杂交系统、SOS富集系统等。酵母双杂交及其衍生系统已经成功地运用于蛋白质之间,蛋白质与DNA、RNA、配体之间相互作用的研究。     

酵母双杂交系统的应用与改进

酵母双杂交系统是一种体内研究蛋白质相互作用的非常有效的分子生物学方法,自建立以来得到了不断的改进与发展,并衍生出单杂交系统、三杂交系统、方向杂交系统等一系列相关技术,在蛋白质组学及药物开发研究中发挥了重要作用。