野油菜黄单胞菌8004胞外酶及多糖合成正负调控基因在X.c.NK01菌中功能初探

利用野油菜黄单胞菌（Xanthomonascompestris）8004正、负调控胞外酶及多糖合成的基因片断分别经三亲本接合方法导入黄单胞菌NK01抗性突变株中，测定接合于四种胞外酶活力和多糖合成能力，确定该正、负调控基因对NK01的作用．结果表明，负调控基因作用明显，使NK01胞外多糖及胞外酶产量显著降低，正调控基因未见明显的胞外酶及多糖合成的增强作用．本文并对正、负调控基因的作用方式作了初步探讨．     

快速发酵淀粉产生胞外多糖的野油菜黄单胞菌S—152菌株的研究

分离到一株野油菜黄单胞菌,接种在4%的淀粉培养基中15h,能使淀粉完全液化。发酵48h即能产生23—29g/l 胞外多糖。此多糖的性能和结构与美国产品Xanthan 相同。     

野油菜黄单胞菌X.c—18的选育及发酵条件的研究

通过人工诱变野油菜黄单胞菌，筛选出１株具有良好抗变异性的突变株Ｘ．ｃ－１８。该突变株能很好地利用蔗糖和玉米淀粉为碳源，蛋白胨和黄豆饼粉为氮源。其最佳黄原胶发酵总糖量与总蛋白质量之比为５：０．５，最适ｐＨ值为７．０，温度为２８℃。摇瓶发酵７２ｙ，黄原胶产量每升发酵液一般可在３０ｇ以上，最高产量达３２．６ｇ，对碳源转化率为７１．５４％。     

野油菜黄单胞菌色素的分离与稳定性研究

液体发酵野油菜黄单胞菌,生产大量菌液,通过离心、浓缩获得野油菜黄单胞菌色素干品,进行热、光照、酸碱度对色素稳定性的影响试验。结果表明,野油菜黄单胞菌黄色素在高温、长时间光照、强酸碱度条件下,性状稳定,吸收波长稳定在330 nm。     

野油菜黄单胞菌中胞嘧啶脱氨酶注释基因的功能鉴定

胞嘧啶脱氨酶广泛存在于细菌、真菌中,而植物缺乏胞嘧啶脱氨酶,提示胞嘧啶脱氨酶可作为病原细菌的潜在药物靶标.胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶和氨,是嘧啶补偿途径中的关键酶,对一些动物病原细菌的致病性至关重要.胞嘧啶脱氨酶催化5-氟胞嘧啶脱氨形成5-氟尿嘧啶和氮,而5-氟尿嘧啶对细菌是致命毒性的.在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)8004菌株的基因组中,XC0670注释为胞嘧啶脱氨酶基因.BLAST和SMART分析发现,XC0670、XC1949和XC3413编码的蛋白都具有核苷脱氨酶结构域.本工作分别构建了XC0670、XC3413的缺失突变体,从Xcc 8004突变体库中调出XC1949 Tn5插入突变体.由于各个突变体与野生型一样在含5-氟胞嘧啶的MMX培养基上不能生长,在以胞嘧啶为唯一氮原的NNM培养基上都能生长,而含有XC0670、XC1949、XC3413组成型表达构建的大肠杆菌在含5-氟胞嘧啶的LA培养基上都能正常生长,GUS活性检测显示这3个基因都不受胞嘧啶诱导.研究结果表明这3个基因都不具有胞嘧啶脱氨酶活性.致病性试验和致病生化因子检测表明,XC0670、XC3413与Xcc致病性、胞外酶、胞外多糖无关,XC1949与Xcc致病性相关,而与胞外酶、胞外多糖无关.     

缩酮丙酮酸转移酶基因在野油菜黄单胞菌中的表达

将野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＮＲＲＬ－Ｂ－１４５９菌株的缩酮丙酮酸转移酶基因,在ｐＲＫ２０７３辅助质粒的协助下,经三亲本接合法,导入野油菜黄单胞菌ＮＫ０１小菌落的抗性突变株（ＮＫ０１·Ｓ·１）中,测定各接合子的产胶率、黄原胶粘度及丙酮酸含量,得到一系列优于原始菌株的接合子,其中四株的产胶率、丙酮酸含量及黄原胶粘度分别较出发菌株提高７．２８～１０．６０％、４０．２４～４１．４２％和１０．７９～２２．３０％．     

缩酮丙酮酸转移酶基因在野油菜单胞菌中的表达

将野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＮＲＲＬ－Ｂ１４５９菌株的缩酮丙酮酸转移酶基因,在ｐＲＫ２０７３辅助质粒的协助下,经三亲本接合法,导入野油菜黄单胞菌ＮＫ０１小菌落的抗性突变株（ＮＫ０１·Ｓ·１）中,测定各接合子的产胶率、黄原胶粘度及丙酮的含量,得到一系列优于原始菌株的接合子,其中四株的产胶率、丙酮酸含量及黄原胶粘度分别较出发菌株提高７．２８￣１０．６０％、４０．２４     

β－淀粉酶基因在黄单胞菌中的克隆及表达

广泛寄主范围载体ｐＫＴ２１０可在辅助质粒ｐＲＫ２０１３的协助下转移进入黄单胞菌（革兰氏阴性）中并能稳定存在；来源于枯草杆菌的β－淀粉酶基因与载体ｐＫＴ２１０形成重组质粒ｐＹＬ１，并以其转化大肠杆菌；通过三亲本接合将ｐＹＬ１引入带有利福平抗性的黄单胞菌ＮＫ０１－Ｒ中，通过抗性选择接合子，并测定接合子的淀粉酶水解能力及产胶能力．本文获得一株黄原胶产量比出发菌株提高２０％，且淀粉酶水解能力显著提高的工程菌株．     

野油菜黄单胞菌NK－01生物合成黄原胶的分子遗传学分析

本文采用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌＩ部分酶切得到ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段，将其连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上，在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中建立完整的ＮＫ－０１基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下，不产多糖突变株分别与含基因文库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群进行三亲接合转移，筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体。对接合后体进行重组质粒的酶切分析表明，所克隆的ＤＮＡ具有片段重叠。上述重组质粒对另外９株不产多糖突变株互补检测及遗传学分析表明，１３．４ｋｂ的ＤＮＡ片段含有合成黄原胶所必需的基因。     

β—淀粉酶基因在黄单胞菌中的克隆及表达

广泛寄主范围载体ｐＫＴ２１０可在辅助质粒ｐＲＫ２０１３的协助下转移进入黄单胞菌（革兰氏阴性）中并能稳定存在；来源于枯草杆菌的β－淀粉酶基因与载体ｐＫＴ２１０形成重组质粒ｐＹＬ１，并以其转化大肠杆菌；通过三亲本接合将ｐＹＬ１引入带有利福平抗性的黄单胞菌ＮＫ－０１－Ｒ中，通过抗性选择接合子，并测定接合子的淀粉酶水解能力及产胶能力。本文获得一株黄原胶产量比出发菌株提高２０％，且淀粉酶水解能力显著提高的工     

黄杆菌（Flavobacterium sp.）ATCC27551 opd基因在E.coli中的克隆及表达

研究了黄杆菌ATCC27551的opd基因在大肠杆菌中的表达,并对于表达产物进行了胞内定位和酶活测定,通过PCR扩增和PCR产物直接克隆,将黄杆菌质粒上的一段长达1137bp和opd基因进行扩增及克隆,然后按正确的读码框亚克隆于表达载体pET28b（ ）上,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导,获得了较高量的基因表达产物,该表达产物以包涵体的形式存在于细胞内,通过分离包涵体可以得到电泳较纯的条带,工程菌的细胞活性达到原始菌株黄杆菌的水平。