小拟南芥液泡膜H~+-PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性起着重要的作用。为了克隆小拟南芥液泡膜H+-PPase基因,采用RT-PCR结合RACE的方法从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了1个液泡膜H+-PPase基因,命名为OpVP1。OpVP1基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP1蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6%、98.4%。系统进化分析表明OpVP1基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP1蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP1蛋白是由2个单体组成的二聚体蛋白。qRT-PCR表明OpVP1基因在角果中表达高于根、茎、叶和花中的表达。     

小拟南芥转运蛋白基因及NHX2基因的克隆与表达

转运蛋白(transport protein)是膜蛋白的一大类,介导生物膜内外的化学物质及信号的交换。植物体内存在多个与Na~+转运相关的蛋白,其中液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白(Vacuolar Na~+/H~+antiporter,NHX)在离子稳态和提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。为了深入了解转运蛋白基因在短命植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)耐盐方面的作用,本研究首先基于小拟南芥响应高盐胁迫叶片转录组数据筛选出1157个转运蛋白基因,按功能分为Na~+转运蛋白,K~+转运蛋白,Ca~(2+)转运蛋白,ABC转运蛋白以及糖转运蛋白等,其中功能注释为Na~+转运蛋白的基因有24个。K均值(K-means)聚类分析结果显示,1157个转运蛋白基因分布于20个K subcluster,其中在K6、K9、K15子聚类中的基因数量分布较多,分别为172、193、190个。在分布于K6子聚类的Na~+转运蛋白基因中,有一个编码NHX2蛋白的基因经盐胁迫处理后明显上调表达。采用RT-PCR克隆了Ap NHX2基因,Ap NHX2开放阅读框1626 bp,编码541个氨基酸。Ap NHX2蛋白是一个典型的跨膜转运蛋白,具有12个跨膜结构区。系统进化分析表明Ap NHX2与拟南芥At NHX2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,Ap NHX2基因在小拟南芥各组织中均有表达,但在花中表达量最高。为进一步研究该基因的功能,构建了过量表达载体35S∶Ap NHX2并转化农杆菌GV3101。本研究为进一步阐述转运蛋白基因在小拟南芥响应盐胁迫中的功能机制奠定了基础。     

拟南芥中MRG2与BAF60相互作用的研究

拟南芥MRG2(Morf Related Genes 2)是MRG蛋白家族成员之一,可以识别组蛋白H3K4和H3K36甲基化修饰,但是对于它是否具有其他生物学功能,目前了解还非常有限.我们首先通过免疫共沉淀结合质谱分析获得了MRG2结合蛋白,并对其中一个染色质重塑SWI/SNF复合体亚基BAF60蛋白进行了深入研究.体外Pull-down和双荧光互补实验证实了MRG2和BAF60在植物体内体外都能相互作用.已有研究表明:BAF60抑制异戊烯转移酶IPT(ISOPENTENYL TRANSFERASE)基因转录.RNA-seq和RT-qPCR数据都表明在mrg1mrg2双突变拟南芥植株中多个IPT基因转录水平明显升高.ChIP实验结果证明MRG2蛋白富集于IPT3基因编码区.综上所述,在植物细胞中MRG2和BAF60蛋白相互作用共同调控了IPT3基因的转录.这些研究对于理解MRG2在基因表达调控方面的功能具有重要意义.     

重组植物AHA2蛋白的真核表达及纯化

AHA2蛋白位于植物细胞质膜上,该蛋白在原核蛋白表达体系中无法重组表达.已经报道的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达体系操作复杂,成本高昂.本文将拟南芥aha2基因(全长2984bp)插入真核表达载体pPICZαA中,线性化质粒pPICZαA-aha2,电转化毕赤酵母X33细胞,通过同源重组获得工程菌.以0.5%甲醇诱导表达72h后,收获细胞.冷冻研磨细胞,离心并收集上清进行亲和层析和分子筛纯化.SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白为97kD的条带.本研究成功的在毕赤酵母X33细胞中实现了拟南芥AHA2蛋白的表达和纯化.     

拟南芥CAS基因的生物信息学分析及超表达载体构建

对拟南芥氰丙氨酸合酶(cyanoalanine synthase,CAS)基因进行了生物信息学分析,并构建了CAS合酶基因的超表达载体,以期为其后续功能研究奠定基础。生物信息学分析结果表明,编码拟南芥CAS合酶的CYS-C1和CYS-D1基因均含有10个外显子和9个内含子,定位于3号染色体,而CYS-D2基因有9个外显子和8个内含子,定位于5号染色体;3个基因编码的蛋白氨基酸序列相似度较高,CYS-C1蛋白偏碱性且主要在线粒体中起作用,而CYS-D1和CYS-D2蛋白偏酸性,主要在细胞质中起作用。通过RT-PCR扩增了拟南芥CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因片段,并构建了超表达载体p BI121-35S-CYS-C1、p BI121-35S-CYS-D1和p BI121-35S-CYS-D2,经检测重组质粒已转化到农杆菌GV3101中。     

激发子诱导拟南芥悬浮细胞的脱敏性反应

通过真空转化法获得转重组水母发光蛋白基因(aeq)的拟南芥.利用这一转基因拟南芥研究植物对两种不同来源激发子---来源于植物细胞壁的寡聚半乳糖醛酸(OGA)与来源于真菌细胞壁的二十五肽激发子(Pep-25)的反应.OGA与Pep-25都可以诱导拟南芥悬浮细胞的过敏性反应,包括[Ca 2+ ] cyto 的升高,H 2 O 2 的产生与胞外介质的碱化.但是拟南芥在用OGA或Pep-25预处理以后,再用OGA或Pep-25处理时所产生的过敏性反应强度明显低于未经OGA或Pep-25预处理而直接用OGA或Pep-25处理的拟南芥悬浮细胞所产生的反应,即发生了同源或异源脱敏性反应.OGA与Pep-25诱导pal与gst的转录也有同源与异源脱敏性反应现象.推测是OGA和Pep-25诱导产生的胞内Ca 2+ 和H 2 O 2 作为第二信使诱导抗性相关基因的转录,OGA和Pep-25诱导[Ca 2+ ] cyto 的变化和H 2 O 2 产生的同源与异源脱敏现象以及OGA和Pep-25诱导pal与gst转录方面表现的同源与异源脱敏现象可能是相关的.     

桃树抗寒相关的叶绿体新基因PpRBD1的克隆及特征分析

为确定桃树细胞质抗寒相关基因,依据模式植物拟南芥中抗寒相关的RBD1基因,结合桃基因组数据设计并克隆到一个桃PpRBD1基因。该基因全长2 230 bp,编码513个氨基酸;结构域分析显示,该氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守结构域,是与拟南芥RBD1同源的蛋白;亚细胞定位预测表明,该基因编码的蛋白可能在叶绿体中表达。该基因可能在桃抵抗寒冷胁迫中发挥重要作用。     

小拟南芥COR15a基因的克隆及序列分析

拟南芥的CORl5a基因受低温处理、ABA及干旱诱导表达,与植物的低温驯化有关。根据拟南芥序列。利用PCR技术从小拟南芥基因组中克隆了AtCORl5a的同源基因ApCOR15a。2个基因具有相同的结构,ApCORl5a编码139个氨基酸,其序列有84％与AtCORl5a蛋白相同。     

花椰菜（Brassica oleracea vat．botrytis）抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731（感病系）和C712（抗病系）作为材料,利用cDNA—AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况．获得了两个阳性克隆M2和M6．Northern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同．而M6是差异表达的cDNA片段．Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列．随后的序列分析发现M6cDNA片段与拟南芥1号染色体的BACF19P19中66665～66813bp有84％同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列．推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91％同源性．用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现：M6cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势．根据序列分析和初步的功能分析的结果推测：M6cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段．是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段．     

拟南芥突变体lac8-2和lac8-3的鉴定

本课题组已通过基因工程方法证实,拟南芥At5g01040的编码蛋白Lac8具有漆酶活性.本研究通过PCR扩增技术,成功筛选出Lac8基因的T-DNA插入突变体lac8-2和lac8-3的纯合子.RT-PCR分析表明,突变体中没有Lac8基因的表达.因此,lac8-2和lac8-3均可作为Lac8基因的功能缺失突变体,这为进一步研究Lac8基因在拟南芥生长发育中的功能奠定了材料基础.     

拟南芥AtSuc3和AtSuc4基因的克隆及双价植物表达载体的构建

蔗糖转运蛋白在调节同化产物的分配过程中起重要作用。为了分析拟南芥蔗糖转运蛋白基因AtSuc3、At-Suc4的功能和协同作用,以哥伦比亚型拟南芥为材料,通过RT-PCR技术克隆了蔗糖转运蛋白基因(sucrose/H+cotransporters,SUCs)AtSuc3和AtSuc4的cDNA,利用甘薯贮藏蛋白基因(sporamin)的根部特异性启动子,构建了含有含有AtSuc3和AtSuc4 cDNA的单价植物表达载体pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4和双价植物表达载体pBI2301-q3-s3-q4-s4,为进一步分析该植物表达载体在调控库源关系中的作用以及在经济作物中的应用奠定基础。     

人参亲环素基因表达载体构建及其在拟南芥中的抗盐活性分析

摘 要 为研究人参亲还素基因的抗盐活性,为该基因在人参抗逆育种方面的应用提供参考,通过植物转基因技术和外施不同浓度NaCl的方法获得阳性拟南芥植株,研究了不同植株类型不同盐浓度下的种子萌发率、植株生存率、植株主根长、植株分支数等相关指标。结果表明：在盐胁迫作用下转基因拟南芥种子萌发率高于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株生存率显著高于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株主根长大于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株分支数与野生型拟南芥植株分支数没有明显差异。可见人参亲还素基因提高了转基因拟南芥抵御高盐胁迫的能力。     

拟南芥中一个镍离子转运蛋白的亚细胞定位

离子的跨膜转运是细胞获取养分的重要环节,亦是植物在组织和器官水平上进行养分吸收运移的基础．在植物中镍（Ni）元素主要以Ni^2＋的形式存在,并通过Ni^2＋转运蛋白将其跨膜转运至相应的组织器官,参与氢酶和脲酶的合成．生物信息学分析表明,拟南芥中一个Ni^2＋转运蛋白AT2G16800含有叶绿体定位信息．克隆该基因5’端编码转运肽的272bp片段,与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合后,在拟南芥中高效表达,对其进行了亚细胞定位的研究．转基因植株通过共聚焦扫描显微镜的观察,发现GFP荧光信号只存在于叶绿体中,该结果表明A他G16800为叶绿体蛋白．     

拟南芥AtHHR3响应热胁迫应答的初步分析

拟南芥基因AtHHR3编码一个RING结构域的E3连接酶,通过生物信息学分析发现其可能参与植物热胁迫相关的应答.为了探索其具体的功能,构建了AtHHR3互补株系,并在DNA水平和转录水平分别鉴定了AtHHR3互补株系,用RT-PCR技术分析了AtHHR3在热处理条件下基因表达的变化情况.在热胁迫下分析了野生型、突变体athhr3、回复株系幼苗存活以及种子萌发的表型变化情况,发现突变体athhr3表现出对热胁迫的耐受性,并检测了热胁迫下不同株系的HSF、HSP等热相关基因的转录水平的变化,初步的研究表明拟南芥基因AtHHR3负调控植物对热胁迫的耐受性.     

Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana

The flowering plant Arabidopsis thaliana is an important model system for identifying genes and determining their functions. Here we report the analysis of the genomic sequence of Arabidopsis. The sequenced regions cover 115.4 megabases of the 125-megabase genome and extend into centromeric regions. The evolution of Arabidopsis involved a whole-genome duplication, followed by subsequent gene loss and extensive local gene duplications, giving rise to a dynamic genome enriched by lateral gene transfer from a cyanobacterial-like ancestor of the plastid. The genome contains 25,498 genes encoding proteins from 11,000 families, similar to the functional diversity of Drosophila and Caenorhabditis elegans--the other sequenced multicellular eukaryotes. Arabidopsis has many families of new proteins but also lacks several common protein families, indicating that the sets of common proteins have undergone differential expansion and contraction in the three multicellular eukaryotes. This is the first complete genome sequence of a plant and provides the foundations for more comprehensive comparison of conserved processes in all eukaryotes, identifying a wide range of plant-specific gene functions and establishing rapid systematic ways to identify genes for crop improvement.     

邻单胞菌邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfdC)在拟南芥中表达的初步研究

将从一株邻单胞菌中克隆到的一个新的邻苯二酚1，2－双加氧酶基因（tfd C)的起始密码子由GTG突变成ATG，并克隆到农杆菌双元载体pPZPY122中，利用农杆菌介导转化模式植物拟南芥，获得了转化植株，经过PCR，PCR－Southern和Southern dot blot方法检测证实，ftd C基因已经整合到拟南芥基因组中，邻苯二酚1，2－双加氧酶酶活性检测表明，转基因植株具有一定的酶活性，而未转化的植株则不具有酶活性。     

毛白杨果胶甲酯酶PtoPME34-1调控植物抗旱性研究

为了探究林木植物中果胶甲酯酶PME的功能,本研究中,我们从毛白杨中克隆出拟南芥PME34的同源基因PtoPME34-1,阐述了该基因在毛白杨中的生物学功能.生物信息学分析表明,毛白杨PtoPME34-1基因与毛果杨PtrPME34-1序列相似性为100%,与拟南芥AtPME34序列相似性为93%.组织特异性表达分析显示PtoPME34-1基因在所有组织都有表达,在基部茎、木质部的表达量较高,在老叶表达量最低.蛋白亚细胞定位结果显示,绿色荧光蛋白GFP标记的PtoPME34-1-GFP融合蛋白定位在烟草叶片细胞壁.毛白杨PtoPME34-1基因过表达显著提高植株的抗旱性.毛白杨PtoPME34-1和PtoPME34-2基因的双突变体植株中果胶甲酯化程度升高,且植物抗旱性也显著增加.这些研究结果证实PtoPME34-1在调控植物生长发育和抗旱胁迫中发挥重要作用.     

拟南芥抗油菜黑胫病突变基因的遗传分析及染色体定位

以拟南芥黑胫病感病突变体及抗病野生型为材料,对不同世代群体进行遗传分析,结果表明,该突变性状为细胞核内两对重叠作用的基因所控制,感病植株为隐性突变体,其基因型为sc1sc2.同时对突变位点sc1及sc2进行了染色体定位研究.结果证实, sc1位于1号染色体的长臂上,sc2位于2号染色体的长臂上.为进一步研究拟南芥抗病功能基因奠定了基础.     

南方菟丝子18S rRNA基因片段的克隆与序列分析

根据拟南芥光敏色素B基因序列设计引物, RT-PCR扩增南方菟丝子同一基因相应片段, 扩增使用了TD PCR技术,同时获得3个特异基因片段,对长约300 bp的片段克隆后进行序列分析,显示该片段与沼泽菟丝子和拟南芥18S rRNA基因相应片段的一致性分别为98.9%和97%,结果表明,该片段为南方菟丝子18S rRNA基因片段.     

棉花DELLA蛋白GhGAl4a基因在拟南芥中功能初步分析

为了探究棉花DELLA蛋白基因GhGAI4a在拟南芥中的功能,构建植物表达载体pBP35S：GhGAI4a和pBP35S：Ghgai4a,利用农杆菌介导的花滴法将其转入Col野生型拟南芥。结果显示,2个载体各自获得6个独立的转基因拟南芥纯合株系。分别统计48—96h种子萌发率,测量生长7d后幼苗的主根长度,与非转基因植株相比,过量表达GhGAI4a、Ghgai4a对拟南芥种子萌发及主根生长具有明显的抑制作用。1μmol／LGA处理转基因植株,GhGAI4a转基因植株主根长和萌发率均增大,而Ghgai4a转基因植株主根长度和萌发率均无显著变化。