猪圆环病毒Ⅱ型抗体检测ELISA试剂盒的制备

猪圆环病毒(PCV)两个血清型中只有PCV2为致病性病毒.将ORF2蛋白作为抗原建立区别两型PCV的血清学检测方法.去除N端信号肽的ORF2片段在大肠杆菌中BL21(DE3)中进行了表达.SDS-PAGE凝胶电泳表明在26 k D处有一个明显的表达条带,并且可以和猪圆环病毒阳性血清发生反应,表明重组蛋白表达成功.以表达的ORF2蛋白作为包被原,建立了检测猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法.与商品化试剂盒同时检验78份临床血清,符合率为95%;同时与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒均无交叉反应.     

猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达

目的表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持。方法根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/LIPTG诱导。结果表达产物以包涵体的形式存在,经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

II型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达与初步应用

II型猪圆环病毒(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORF2为模板,扩增截短的ORF2(tORF2)基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-tORF2并转化大肠杆菌BL21(DE3).经SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的tORF2,重组蛋白分子量约为45ku,表达量约为菌体总蛋白的20%,重组蛋白具有良好的免疫学活性.用tORF2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)阳性猪血清进行Western blot检测,有4份(20%)血清显示PCV2抗体阳性,说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象.本研究初步证明表达的tORF2重组融合蛋白可以应用于临床检测.     

新型PCV2衣壳融合蛋白在HEK293F细胞瞬时表达研究

猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2,PCV2）衣壳（Capsid）蛋白是制备抗猪圆环2型病毒亚单位疫苗的有效免疫抗原,能在大肠杆菌及杆状病毒/昆虫细胞表达系统中获得表达,然而在哺乳细胞中的表达研究仍然缺乏。瞬时表达条件考察结果显示,采用宿主HEK293F细胞及PEI-40kDa转染试剂能获得35%病毒PCV2 Capsid基因细胞转染效率。转染试剂PEI(Polyethylenimine)与DNA比例差异会影响复合物形成大小及形态,复合物形成15～80 nm颗粒有利于转染效率的提高。实验以免疫逃逸型猪圆环病毒2b型NDSU41513病毒株,设计了新型PCV2 Capsid (△1-41aa)-Fc(pig) protein(PCFP)分子。在3 L反应器中成功实现了HEK293F细胞瞬时表达PCFP,表达水平达到3.8 mg/L。PCFP蛋白能够自主装形成约为41 nm类病毒颗粒,诱导小鼠机体内产生强烈的体液免疫反应,具有很高的应用潜力。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白B细胞表位的预测及鉴定

利用生物信息学技术和原核表达系统,筛选猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白(Cap)的B细胞表位,为进一步揭示PCV2的免疫调控机制提供研究依据.运用生物信息学软件预测PCV2 Cap蛋白的亲水性、表面可及性、蛋白柔韧性、抗原性和B细胞线性表位;根据预测结果,初步确定Cap蛋白潜在的B细胞线性表位主要位于58~66、79~91、151~162、174~189、204~213和221~233位氨基酸.设计特异性引物,扩增Cap蛋白潜在表位区域基因,并克隆到p ET32a(+)原核表达载体上,转化至表达菌BL21(DE3)plys S中,在IPTG诱导下表达目的蛋白;利用PCV2阳性血清鉴定Cap蛋白的B细胞线性表位,筛选出3个能与血清结合的肽段,即Cap77-95、Cap174-189和Cap221-233;对获得的肽段进行在线同源比对,发现3个片段均为PCV2 Cap蛋白的特有序列,有可能成为PCV2的特异性表位.     

Ⅱ型猪圆环病毒ORP2基因的原核表达与初步应用

Ⅱ型猪圆环病毒（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的重要病原．本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORP2为模板，扩增截短的ORP2（tORF2）基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3，构建重组表达质粒pGEX-tORP2并转化大肠杆菌BL21（DE3）．经SDS-PAGE及Western blot鉴定，成功表达了谷胱甘肽S转移酶（GST）融合的tORP2，重组蛋白分子量约为45ku，表达量约为菌体总蛋白的20％，重组蛋白具有良好的免疫学活性．用tORP2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）阳性猪血清进行Western blot检测，有4份（20％）血清显示PCV2抗体阳性，说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象．本研究初步证明表达的tORV2重组融合蛋白可以应用于临床检测．     

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141~160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141~160aa-21~40aa-141~160aa(BTB),构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20~30nm大小的目的颗粒.     

鸡致病性E.coli O_(24)基因工程包涵体疫苗的制备及免疫原性

利用已构建的基因工程菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分别可见表达的20ku和40.9ku的特异条带,确定蛋白以包涵体的形式存在.Western blot结果表明,表达的Ⅰ型菌毛蛋白(pilA基因编码)和外膜蛋白(ompC基因编码)可与抗体发生特异性结合,说明其具有良好的反应原性.将表达特异蛋白的重组菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC分别制成基因工程包涵体疫苗,免疫小鼠后,具有很好的保护能力.ELISA结果显示,免疫的小鼠体内已产生相应的抗体,效价为1∶400,说明这2种疫苗有很好的免疫原性.表明这2株基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株.     

MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究

研究表明,口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的VP1蛋白含有关键的抗原决定簇.根据O/HL-JOC12/03猪源FMDV毒株VP1上第141～160位氨基酸序列设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术将该序列插入在大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点.然后连接到原核表达载体pET28a上,构建了重组表达质粒28a-CP-VP1,转化BL21(DE3),ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1.透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)状.间接ELISA实验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FM-DV的阳性血清,30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后可以诱导其产生高效价的特异抗体.故该口蹄疫病毒抗原决定簇展示在噬菌体MS2上表面的VLPs蛋白具有开发成口蹄疫疫苗的前景.     

Ⅰ型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白L基因片段的克隆及高效表达

 采用PCR方法扩增HSV-1病毒型特异性包膜糖蛋白L(gL)基因片段并克隆至原核表达载体pGEX-5X-1获得重组质粒pGEX-5X-1-gL,将重组质粒转化E.coli BL21表达菌后经IPTG诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE蛋白检测表明,在分子质量56 ku处有HSV-1 GST-gL融合蛋白的高效表达,通过IPTG浓度筛选和诱导前表达菌扩增培养时间的比较分析对诱导条件进行了优化,GST-gL融合蛋白表达量可达到菌体蛋白总量的48.65%.Western blot中利用HSV-1灭活病毒获得的多克隆抗体确证所表达蛋白为HSV-1病毒组分.这一表达系统的建立和优化对进一步探讨HSV-1 gL蛋白功能及其免疫原性提供了有利条件.     

猪圆环病毒的分子生物学特性及诊断方法

猪圆环病毒(PCV)病是近年来阻碍养猪业发展的重要传染病,PCV因而成为各国学者的研究热点.本文就猪圆环病毒的基因组结构与功能,主要的编码蛋白质及其功能,分子生物学诊断方法等领域的最新研究进展进行了综述.     

甜菜夜蛾多核壳型核型多角体病毒vp39基因的克隆与表达

参照苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV)衣壳蛋白基因vp39的序列设计引物,采用PCR技术扩增了甜菜夜蛾核型多角体病毒的约1．3kb片段,通过将片段亚克隆至原核表达载体pET-28构建出重组表达质粒pET-Se39,以pET-Se39转化E.coli BL21。经IPTG诱导后,SeMNPVvp39基因高效表达,SDS－PAGE分析显示表达产物的分子量为39KD,并且表达量在IPTG诱导4h达到最高水平。／     

重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫

将动物生长抑素(SS)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合基因插入p ET28a系统,构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)p ET28a-A4030-2-LTB,然后使用SDS-PAGE检测该融合蛋白的表达并优化其发酵与包涵体洗涤条件,接着采用亲和层析法进行纯化,并用Western Blotting技术检测该融合蛋白的免疫原性.研究结果表明,在37℃,加入1 mmol/L的IPTG培养3 h后,融合蛋白的表达量最高且稳定表达;在包涵体洗涤的过程中,使用含有φ=1%的Triton X-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体沉淀,其效果最佳,用Western Blotting方法检测出该蛋白能发生抗原抗体反应,并且将重组蛋白免疫7只小鼠后,其中有6只小鼠产生了抗SS抗体,表达产物具有免疫原性.此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.     

家畜口蹄疫新型疫苗研制与生产工艺创新2014年度报告

<正>在研制的口蹄疫新型疫苗有10多种,分别是纳米微球黏膜免疫疫苗,表位肽疫苗、口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗、A型重组毒株(Re-A/WH/2009)的口蹄疫O型、A型、亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗、猪口蹄疫O型广谱基因工程病毒灭活疫苗、口蹄疫O型标记疫苗、猪O型Mya98毒株空衣壳疫苗、猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)、牛口蹄疫(O型、Asia1型)二价合成肽疫苗、以及口蹄疫病毒活载体疫苗。其中取得突破性进展的有5种,牛口蹄疫(O型、Asia1型)二价合成肽疫苗PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,已完成所有实验室研究和临床试验,申请了新兽药注册并已通过初审;猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,已完成所有实验室研究和临床试验,现已申请新兽药注册并通过复核试验和复审;含A型重组毒株(Re-A/WH/2009)的口蹄疫O型、A型、亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,获得了农业部新兽药注册证书,实现了产业化;猪口蹄疫O型广谱基因工程病毒灭活疫苗已申报农业部临床试验批文;口蹄疫O型标记疫苗已完成疫苗质量研究,并已申请新兽药注册。其他疫苗研究也均取得了程度不等的进展。利用反向遗传操作技术平台,获得基因工程修饰病毒疫苗株5株:(1)r V-STN-5;(2)9O/r V-1;(3)Re-A/WH/2009;(4)Re-Mya/98/BY/2010;(5)Re-Asia1/HN/2006。利用基因克隆、重组等技术,获得其他基因工程修饰病毒9株,分别为:(1)表达O型FMDV不同亚型主要免疫原性基因的重组伪狂犬病毒1株;(2)共表达O-A-Asia1型FMDV主要免疫原性基因的重组伪狂犬病毒1株;(3)表达FMDV免疫原性基因的杆状病毒2株;(4)表达猪源IFN-α/IFN-γ和A型FMDV P1基因的重组杆状病毒3株;(5)表达口蹄疫和小反刍兽疫病毒主要保护性抗原基因的重组羊痘病毒2株。成功研制Cp G-IFN、Cp G-IL4以及多磷腈和Cp G DNA等生物复合佐剂3种,纳米乳油佐剂、纳米粒IL-2佐剂以及多孔硅和上转换荧光纳米材料的载药系统等纳米复合佐剂材料4种,以及IL-2、IL-4和IFN-γ等多种哺乳动物细胞表达质粒和多糖类免疫增强剂4种。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

衣壳蛋白缺失突变对登革病毒致病性及免疫原性的影响

在登革2型病毒中国分离株(DEN2—43)的感染性全长cDNA克隆的基础之上,利用融合PCR技术构建衣壳蛋白基因缺失的全长cDNA．将其线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔法导入宿主细胞获得缺失突变病毒,对其致病性和免疫原性进行了观察．结果显示,随着衣壳蛋白缺失氨基酸残基数目的增加,病毒在敏感细胞中的增殖能力逐渐减弱,而衣壳蛋白第3个α螺旋序列缺失的突变体则完全丧失感染性．突变病毒对乳鼠的致病性也随之减弱,缺失10个氨基酸残基使病毒几乎完全丧失乳鼠致病力．同时缺失突变病毒可诱导小鼠产生高水平IgG抗体．表明登革病毒衣壳蛋白具有功能灵活性,可作为减毒突变的靶位点．该结果为深入探讨登革病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革减毒疫苗奠定了基础．     

鳗鲡病原菌二联外膜蛋白基因工程表达载体的构建

根据鳗鲡病原性嗜水气单胞菌Ⅱ型孔蛋白(porinⅡ)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白S(ompS2)的基因全长序列,分别选取这两个全长序列中表达其蛋白质膜外部分且理论免疫原性较好的两个基因片段,通过融合PCR技术连接这两个外膜蛋白基因片段.根据表达载体(pGEX-2T-His)的限制性酶切位点在连接序列片段的两端引入限制性酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ,成功构建了双外膜蛋白基因片段重组表达载体(pGEX-2T-His-porinⅡ-ompS2).表达载体理论表达产物的蛋白质结构预测表明表达产物无信号肽和跨膜区,不存在三级结构;亲水性和免疫原性预测分析表明该表达蛋白理论上为可溶性蛋白并具有丰富的抗原决定簇,本研究为该表达载体的蛋白表达、纯化以及表达产物的免疫原性研究奠定了基础.     

藏猪白细胞介素-12基因表达对猪圆环病毒2 疫苗的免疫增强效应

为研究IL-12基因在猪体内表达对PCV2疫苗免疫应答的调控作用,本研究将藏猪IL-12基因克隆至VR1020载体,壳聚糖包裹重组质粒制备成壳聚糖纳米颗粒(VRIL-12-CNP)并与PCV2疫苗共同接种21日龄断奶仔猪.接种后第0d、7d、14d和28d采集猪前腔静脉血进行血细胞分析、PCV2抗体检测和相关免疫基因表达量检测,并记录体重.结果显示:接种VRIL-12-CNP和PCV2疫苗的实验组猪的CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞和PCV2抗体显著增长(P0.05),TLR2/7、IL-12/4/6/15、STAT1/3和Bcl-2基因的表达量显著高于对照组(P0.05);试验期间实验组体重净增长也明显高于对照组(P0.05).结果表明:VRIL12-CNP能增强PCV2疫苗的先天性和获得性体液、细胞免疫应答,是安全、有效的PCV2疫苗佐剂.     

构建重组人CatSperl特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-590)原核表达载体并表达重组抗原.方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体.测序鉴定后转化工程菌株E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白.用TricineSDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况.结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白.Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原.结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsperl特异抗原.