用ENU诱导斑马鱼突变的初步研究

斑马鱼作为一种脊椎动物发育模型, 正越来越受到重视. 用ENU诱变的方法, 建立了320个斑马鱼F2家系. 通过对F3代胚胎的表型观察, 鉴定在外包、体轴、体节、头部、心血管系统等表现异常的突变体. 目前已获得35个突变品系, 其中以体轴和体节异常的突变体为主. 这些突变体斑马鱼品系的建立为克隆突变的基因、研究胚胎早期发育机制打下了良好的基础.     

高通量筛选ENU诱变产生的遗传疾病小鼠模型

由于小鼠和人类基因组的高度同源, 修饰和改造小鼠基因组已经成为建立人类疾病模型和研究基因功能的最重要的手段. 通过C57BL/6J雄性小鼠的ENU化学诱变和子代的表型筛选的方法, 对G₁代3172只小鼠的形态学、行为学、神经功能、学习记忆、听力、视觉生理、骨代谢、血糖和心功能等一系列生理生化指标进行了高通量检测, 筛选出595只与人类疾病相关的显性基因突变个体, 其中毛色转换、眼疾和听力缺陷发生频率较高, 而代谢性异常的显性突变率较低, 提示血糖和心电等重要代谢功能的遗传调控稳定性高于外周神经系统功能. 小鼠单侧性眼疾存在明显的雌雄不均一性和左右不对称性. 骨密度异常与小鼠性别也有一定相关性. 在对104只G₁代突变小鼠和野生型小鼠交配的可遗传性检测中, 已有14只的异常表型被确认可以遗传, 其中行为学异常小鼠的可遗传性较低, 提示行为学异常可能和多基因突变相关. 这些突变小鼠品系的建立, 为疾病表型的发生和病理过程的细胞生物学及分子生物学机制研究、突变基因的染色体定位和克隆奠定了良好的基础.     

值得关注的小鼠ENU诱变研究

本期《科学通报》发表了扬州大学李厚达课题组和南京大学高翔课题组关于用乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea,ENU)诱发小鼠基因突变的研究论文,标志着我国科学家在小鼠基因组水平进行大规模随机诱变实验已经起步,值得关注。     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.     

通过mRNA差异显示分离一个新的斑马鱼胚胎发育基因

无脊椎动物果蝇形态发生分子机理被揭示之后,脊椎动物形态发生分子机理的研究成为发育生物学的研究焦点。作为脊柱动物研究模型的斑马鱼,其胚胎发育基因的分离无疑是进行该研究的入手点。分离斑马鱼胚胎发育基因有我种有效方法可供选择。本文用ｍＲＮＡ差异显示技术对斑马鱼受卵精后４,５和６ｈ的胚胎的ｍＲＮＡ进行了差异显著显示,对其中一个神经胚特异的ｃＤＮＡ的片段进行了克姓和序列分析,与Ｇｅｎｂａｎｋ中已有的基因序列     

用整体原位杂交法研究微管蛋白基因在斑马鱼胚胎中的表达

斑马鱼是一个很好的脊椎动物发育研究模型,斑马鱼胚胎发育过程中基因表达调控的研究对揭示脊椎动物形态发生的分子机理非常重要。微管蛋白固定受精卵细胞质中的形态发生决定子,组织形成基本的细胞骨架,控制细胞的各种运动。在脊椎动物中已发现有几种微管蛋白,每种微管蛋白都有其特定的表达位点和功能。用一种β２微管蛋白基因的全长ｃＤＮＡ为模板,合成地高标记的ＲＮＡ为探针,对斑马鱼各时期的胚胎进行整体原位杂交。β２微管     

新药研发: 小斑马鱼, 大机遇

斑马鱼体积小、发育迅速、胚胎透明、产卵量高, 在信号转导通路、形态学以及生理学方面和哺乳类动物极
其相似, 这些独特优势使得斑马鱼成为人类疾病研究和活体高通量药物筛选的最佳模式生物体之一。近年来, 科学
家们不断地发展出新的斑马鱼疾病模型和新的筛选技术, 利用斑马鱼已经鉴别出多个活性化合物, 并成功通过审批
进入人体临床试验。文章概括介绍了近年来有关斑马鱼的研究在人类疾病模型和药物开发方面所取得的进展, 希望
能够帮助人们了解斑马鱼在新药研发中的应用。     

模式生物斑马鱼在心血管疾病研究中的应用

斑马鱼近年来被广泛地应用于医学研究中。斑马鱼个体小、养殖费用低廉、身体透明,及易于基因操作等优势,使其成为一种理想的模式生物。笔者综述了模式生物斑马鱼在心血管疾病研究中的应用。首先介绍了斑马鱼的心血管发育、心血管影像、相关遗传学技术及斑马鱼作为模式生物在心血管疾病研究中的优势与不足;然后通过总结既往的研究,重点阐述了斑马鱼在动脉粥样硬化、心律失常、心肌病、先天性心脏病、心力衰竭、心脏再生、炎症、动脉生成、血栓及心血管药物筛选等领域的应用进展。     

棉花短纤维突变体纤维伸长的电镜观察

以棉花等基因系超短纤维突变体(Ligon Li₁)及其野生型(Ligon li₁)为材料, 观察在田间生长和离体培养条件下纤维的超微结构, 分析纤维伸长的细胞学特点. 结果发现, 在田间条件下, 与正常纤维相比, 突变体纤维在伸长趋向停止时, 细胞质稀薄, 小液泡增多, 线粒体、高尔基体和内质网减少, 细胞壁附近有较多游离或包含在质体中的淀粉粒, 推测功能性细胞器的缺乏和淀粉的糖转化受阻是突变体纤维细胞过早退化和停止伸长的主要原因. 在离体条件下, 突变体胚珠在含GA₃的培养基中产生一种因生长快而形成的巨大愈伤组织, 它的表面覆盖一层白色、疏松、半透明、脆而易脱离胚珠的拟纤维细胞. 这种拟纤维细胞常被细胞壁分截, 形成不同于单细胞正常纤维的多细胞纤维, 且有黑色斑点分布, 如同田间棉花茎和叶上的色素腺体. 多细胞纤维质膜处有大量的微管, 初步具备次生壁沉积的条件, 推测赤霉素(GA₃)可诱导在田间自然条件下沉默的与纤维细胞分裂相关基因的表达, 从而刺激表皮细胞己分化完成的原始纤维细胞再次迅速分裂.     

不用“补觉”的斑马鱼

一项新的研究显示,即使被剥夺一晚上的睡眠,斑马鱼也不会在第二天打瞌睡。也就是说与哺乳动物相比,鱼类更擅长依靠白天的光亮保持清醒状态;同时也说明在进化过程中,不同物种形成了不同的睡眠调节机制。斑马鱼是目前生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一。     

玉米遗传突变体群体创制和干旱反应突变体筛选与鉴定

利用自主性Mutator转座子玉米材料115F,330I,715D与玉米自交系材料B73,Mo17,97108,H9-21杂交,获得F1插入诱变群体,F1自交得F2群体.在田间观察F2单株的生物学特征及农艺学性状的表型变异,得到不同表型的突变体,对突变体进行了统计分析.在干旱胁迫下,利用远红外热成像仪对室内小钵种植的F2群体三叶期幼苗进行叶片温度的大规模扫描检测,选取叶温有明显差异的植株作为潜在突变株,共检测了38000余株,成功筛选到108株抗旱单株,121株旱敏感单株.通过重复红外温度检测、叶绿素荧光分析、叶片失水、光合特性分析和可溶性糖类、可溶性蛋白和脯氨酸含量测定对突变体进行了初步的鉴定分析.利用MuTAIL-PCR对获得的突变体进行基因克隆.该研究为深入开展玉米抗旱育种提供了实验材料.     

玉米粉质胚乳突变体的研究进展

玉米是世界上重要的粮食作物,也是植物分子遗传研究的重要模式。通过对玉米的长期研究积累了大量的遗传突变体,其中有一类籽粒突变体被称为粉质（opaque 或floury）胚乳突变体,表现为籽粒硬度和透明度下降。同时,这类突变体中的opaque2 等,被发现能够显著改善玉米籽粒的蛋白营养水平,使得粉质胚乳突变体受到了很大的关注。早年只有少数的粉质胚乳突变体基因被克隆和研究,如opaque2 和floury2 等,被发现与玉米主要的储藏蛋白转录和合成有关。近年来,随着科学技术和研究能力的提高,更多的opaque突变体基因,如opaque1、opaque5、opaque7 等,被克隆和研究,为我们揭示了玉米籽粒中储藏物质的合成、转运等更深入的调控机制,拓展了我们对玉米胚乳发育和代谢的知识。     

利用GATA-2调控成分制备组织特异性表达GFP的转基因斑马鱼

ＧＡＴＡ－２是在多种血细胞和神经细胞表达的一种转录因子,调控血细胞和神经细胞的分化。利用斑马鱼ＧＡＴＡ－２基因５’侧翼调控序列和绿色荧光蛋白基因,获得了只在中枢神经细胞表达ＧＦＰ,或在神经细胞和表层细胞都表达ＧＦＰ的转基因斑马鱼种质系,同时还进一步证实了ＧＡＴＡ－２基因在胚胎发育中的时空表达谱。     

3种致遗传病PITX2突变体功能的比较研究

角膜环状皮样瘤(RDC)、虹膜发育不全(IH)和Axenfeld-Rieger综合征(ARS)都是常染色体显性遗传病, 都可以由于一个转录因子PITX2的突变引起. 在3种疾病中, RDC的症状最轻, IH其次, ARS最重.将分别引起RDC, IH和ARS的错义突变R62H, R84W和T68P定点地引入PITX2野生型cDNA序列中进行分子功能的比较研究. 结果证明, 3种突变体蛋白都可以在真核细胞中稳定表达, 并且都定位在细胞核中. EMSA和转录激活研究显示, 3种突变体功能保留情况不同, R62H在三者中保留了最多的活性, R84W也保留了小部分功能, 而T68P则完全丧失了DNA结合和转录激活能力. 这一结果证实了前人提出的假设, 即PITX2突变体残留活性的多少决定了疾病表型的严重程度.     

水稻白穗突变体基因的鉴定和染色体定位

从一个水稻籼粳交F₆后代自然群体中获得1例白穗突变体, 其成熟植株基部少数叶片中脉呈现白色, 抽穗后穗粒内外稃和枝梗均表现白色. 用突变体作母本与一粳稻恢复系品种制7杂交, 获得一个F₂分离群体. 初步的遗传分析表明, 该突变属单基因隐性性状. 利用已定位的微卫星标记进行连锁分析, 发现该基因位于水稻第1染色体上. 进一步根据已完成的水稻基因组序列寻找微卫星位点, 连锁分析显示, 该基因位于微卫星标记SSR101和SSR63.9之间, 分别相距2.3和0.8 cM; 并与微卫星标记SSR17呈共分离. 该基因暂定名为wp(t).     

水稻类病变突变体lmi的鉴定及其基因定位

水稻类病变突变体lmi(lesion mimic initiation)是从γ射线诱变的籼稻品种中籼3037的后代中发现的,属于起始型的类病变突变体. 无菌培养、台盼蓝染色及遮光实验表明, 该突变体受光照控制细胞自主性死亡. 遗传分析表明, 该突变性状由一对隐性基因控制. 利用lmi和93-11杂交的F2群体对lmi基因进行初步遗传定位, 发现该基因定位于水稻第8号染色体着丝粒附近的两个微卫星分子标记RM547和RM331之间, 与两者遗传距离分别为1.2和3.2 cM. 进一步利用这两个标记之间发展的CAPS标记 C4135-8, C4135-9及C4135-10对lmi基因进行精细的遗传定位, 结果表明, lmi基因与标记C4135-10共分离. 这一结果为克隆lmi基因奠定了基础.     

水稻阶段性返白突变体的鉴定和候选基因分析

从粳稻品种中花11 的后代中发现了一个叶色突变体sgra, 该突变体幼苗期叶色正常, 而6~8 叶期以后新生叶白化, 随后白化叶转绿. 突变体的遗传分析表明, 该突变体表型受1 对隐性核基因控制. 利用籼粳杂交F2群体对突变位点进行了基因定位, 将其定位于水稻第11 染色体的2 个标记ID343-11 和PSM415 之间, 遗传距离分别为0.9 和1.0 cM. 随后, 利用已公布的水稻序列和SSR标记, 在两标记间发展了9 对新的标记, 进一步将SGRA基因定位在IDM-2 和RM26739 之间, 物理距离约为17.6 kb. 对野生型和突变体候选区段基因组DNA 测序分析表明, 候选基因编码一个ABC 转运蛋白.     

水稻类病变突变体lmi的鉴定及其基因定位

水稻类病变突变体lmi(lesion mimic initiation)是从γ射线诱变的籼稻品种中籼3037的后代中发现的,属于起始型的类病变突变体. 无菌培养、台盼蓝染色及遮光实验表明, 该突变体受光照控制细胞自主性死亡. 遗传分析表明, 该突变性状由一对隐性基因控制. 利用lmi和93-11杂交的F2群体对lmi基因进行初步遗传定位, 发现该基因定位于水稻第8号染色体着丝粒附近的两个微卫星分子标记RM547和RM331之间, 与两者遗传距离分别为1.2和3.2 cM. 进一步利用这两个标记之间发展的CAPS标记 C4135-8, C4135-9及C4135-10对lmi基因进行精细的遗传定位, 结果表明, lmi基因与标记C4135-10共分离. 这一结果为克隆lmi基因奠定了基础.     

水稻早衰叶突变体es-t的遗传分析与精细定位

突变体es-t 是经EMS诱变处理日本晴后筛选获得的, 该突变体主要表现为叶片从苗期开始黄化, 叶绿素含量显著降低, 随着其生长发育发黄的叶片伴有铁锈色的小斑点, 尤以叶尖和叶缘为甚, 表现严重的早衰现象, 故将之命名为es-t (early senescence-temporary). 扫描电子显微镜显示, 突变体叶片表面比野生型的光滑, 且气孔周围缺乏硅质化突起; 另外, 突变体的叶绿体发育不正常, 含有大量大颗粒的淀粉粒; 组织切片则显示突变体的厚壁细胞及维管束的发育表现异常. 遗传分析表明, es-t 为新发现的早衰突变体, 受一隐性基因控制, 借助图位克隆的手段将之定位于42.1 kb 的物理区间内, 为进一步克隆该基因并阐明叶片早衰的分子机制奠定基础.