卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

花生根瘤菌基因组文库的构建

以具有高吸Ｈ２活性的花生根瘤菌Ｌ８－３为出发菌株提取总ＤＮＡ，经ＢａｍＨＩ不完全酶切后，获得２０ｋｂ左右的ＤＮＡ片段，按Ｉｓｈ－Ｈｏｒｏｗｉｃｚ和Ｂｕｒｋｅ方法，与具有多克隆位点的ＣｏｓｍｉｄｐＬＡＦＲ３克隆载体连接，经体外包装、转导Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１，在选择培养基平板上获得１万多个重组克隆子．随机挑选２２个克隆子进行分析，其中１９个克隆子携带外源ＤＮＡ片段，平均长度为２１．４ｋｂ，文库有效克隆子数和插入ＤＮＡ片段均达到建库要求．ＰＣＲ筛选和生物素探针杂交初步结果显示，重组质粒中所携带的外源ＤＮＡ可能含有我们所需的吸Ｈ２基因．     

凤尾菇线粒体DNA片段的克隆与同源性分析

将Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切的凤尾菇线粒体ＤＮＡ插入质粒载体的ｐＢＳ＾＋的ＢａｍＨＩ位点，然后以凤尾基线粒体ＤＮＡ为探针与重组质粒ＤＮＡ进行斑点杂交，筛选到６个阳性克隆，选取其中２个阳性克隆的插入片段分别与来６个属的１３个食用菌品种的线粒体ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，其结果显示两探针能与所有测定的侧耳属品种的线粒体ＤＮＡ杂交，并具多态性，但与其它属线粒体ＤＮＡ只有不同程度的杂交，两探针中Ｈ４的杂交范     

环状芽胞杆菌基因启动子的分离与鉴定

环状芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）总ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ酶切后插入到启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１的ＢａｍＨＩ位点，转化大肠杆菌后，在卡那霉素的平板上筛选到５０个抗性菌落。从随机挑取的２９个抗住菌落所分离到的质粒ＤＮＡ经限制酶切和琼脂糖凝胶电泳后表明，各质粒均有ＤＮＡ插入片段，对２９个样品进行卡那霉素抗性试验显示，抗性最高的可超过１０００μｇ／ｍＬ这表明来自环状芽胞杆菌的某些基因启动子能在大肠杆菌中十分有效地启动基因表达，选取两个最大的克隆ＤＮＡ片段ＢＣ３和ＢＣ６作为探针与Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２．总ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，均获得杂交带。斑点杂交结果表明，这两个ＤＮＡ片段来自不同的基因启动子。对ＢＣ６和ＢＣ３分别进行了限制酶谱分析，并绘制了限制酶图。     

河南西峡恐龙18srDNA片段质颖

按照ｒＤＮＡ的结构特点，将ＤＡ１８Ｓ１，７与其他８种生物的ｒＤＮＡ序列进行排列比较，结果表明这２上序列不是恐龙ｒＤＮＡ片段ＤＡ１８Ｓ７看来更接近一种植物ｒＤＮＡ片段，而ＤＡ１８Ｓ１与２种参与比较的真菌ｒＤＮＡ序列有很高的同源性，它们与脊椎动物ｒＤＮＡ的同源性分别只在６７．８％－７４．１％之间。     

绵羊β—乳球蛋白基因调空序的分离,克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｂｐ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间。     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

克隆蓝藻Calothrix sp.PCC7601 cpcB2A2基因的初步研究

从蓝藻Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．ＰＣＣ７６０１染色体ＤＮＡ中分离出含藻蓝蛋白基因ｃｐｃＢ２Ａ２的略３．８ＫｂＤＮＡ片段，与质粒ｐＵＣ１８重组，构建成一种重组质粒，ｐＰＣ２１８－ＰＣＺ，转化Ｅ．ｃｏｄｉＪＭ１０９，获得了一系列克隆子，经斑点分子杂交和限制性内切核酸酶分析，筛选出了初步认为含有ｃｐｃＢ２Ａ２基因的克隆子。     

酵母人工染色体DNA的大尺度物理图谱分析

以不同ＰＢＲ３２２质粒ＤＮＡ片段作为ＹＡＣＤＮＡ左右臂探针，使用稀切点限制性内切酶和脉冲电泳技术对含有２ｂＡ３的８００ｋｂ ＹＡＣ作了４种限制酶大尺度物理图谱分析。     

鸡腺病毒内蒙古分离株六邻体蛋白基因片段的合成和分子克隆

根据鸡１０型腺病毒以及人２、５、４０、４１型腺病毒、牛３型、鼠１型腺病毒六邻体蛋白基因序列，选择保守区，设计和合成一对引物，以鸡腺病毒内蒙古分离株基因组ＤＮＡ为模板，进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到预期大小的０．５５ｋｂＤＮＡ片段．将此ＤＮＡ片段克隆于ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ位点，筛选重组质粒，进行限制酶切分析和ＰＣＲ检测，得到含有六邻体蛋白基因片段的重组质粒，为进一步开展此病毒分子生物学研究和分子生物学诊断技术的建立创造了条件     

紫云英根瘤菌5个互补结瘤菌株所分离到的重组质粒外源片 …

对来源于紫云英根瘤菌７６５３Ｒ总ＤＮＡ基因文库的５个互补结瘤菌株所分离到的重组质粒ｐＮＲ１０２，ｐＮＲ１０３，ｐＮＲ１０８，ｐＮＲ２０３和ｐＮＲ２１３，ＥｃｏＲＩ酶切表明它们分别携带有一个４．６８，５．０１，５．０４，５．１０或９．３８ｋｂ的外源ＤＮＡ片段。选用１１种内切酶进行单、双酶切分析，建立了重组质粒外源片段的酶切图谱，５个质粒都具有１．７ｋｂ的ＥｃｏＲＩ－ＢｇｌⅡ片段和１．９ｋｂ的ＥｃｏＲ     

嗜麦芽假单胞菌质粒pSH1的限制图谱及km^r标记的克隆

对嗜麦芽假单胞菌Ｐ２菌株的质粒ｐＳＨ１进行了限制酶切分析，确定了Ｂｇ１ Ⅱ，ＥｃｏＲ Ⅰ，Ｐｓｔ Ⅰ，Ｘｂａ Ⅰ，ＢａｍＨ Ⅰ，Ｂｇｌ Ⅰ，及Ｐｖｕ Ⅱ共７种限制性内切酶在ｐＳＨ１，质粒上的切割位点，前４种酶均为单一切点，后３种依次为２，７，５个切点。通过双酶切和部分酶切的方法绘制了ｐＳＨ１质粒的限制酶切图谱。将ｐＧＰ１－２质粒上的卡那霉素抗性基因片段插入ｐＳＨ１，获得了重组质粒ｐＳＨ２．ｐＳＨ２     

河南西峡恐龙18srDNA片段质疑

按照ｒＤＮＡ的结构特点，将ＤＡ１８Ｓ１，７与其他８种生物的ｒＤＮＡ序列进行排列比较，结果表明这２个序列不是恐龙ｒＤＮＡ片段，ＤＡ１８Ｓ７看来更接近一种植物ｒＤＮＡ片段（与金虎尾的同源性达９４％以上），而ＤＡ１８Ｓ１与２种参与比较的真菌ｒＤＮＡ序列有很高的同源性（８８．３％和８９％），它们与脊椎动物ｒＤＮＡ的同源性分别只在６７．８％～７４．１％之间。     

野油菜黄单胞菌NK－01生物合成黄原胶的分子遗传学分析

本文采用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌＩ部分酶切得到ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段，将其连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上，在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中建立完整的ＮＫ－０１基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下，不产多糖突变株分别与含基因文库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群进行三亲接合转移，筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体。对接合后体进行重组质粒的酶切分析表明，所克隆的ＤＮＡ具有片段重叠。上述重组质粒对另外９株不产多糖突变株互补检测及遗传学分析表明，１３．４ｋｂ的ＤＮＡ片段含有合成黄原胶所必需的基因。     

大肠杆菌—分枝杆菌启动子探针型穿梭载体pEQ3的构建

报道了大肠杆菌－分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３的构建过程。证明其保留了在大肠杆菌和分枝杆菌之间的穿梭功能，并具有启动子筛选功能。利用构建的ＰＥＱ３质粒，从卡介苗染色体中筛选出了具启动子活力的ＤＮＡ片段。     

鸡腺病毒内蒙古分离株六邻体蛋白基因片段的合成和分？…

根据鸡１０型腺病毒以及人２、５、４０、４１型腺病毒,牛３型,鼠１型腺病毒六邻体蛋白基因序列,选择保守区,设计和合成一对引物,以鸡腺病毒内蒙古分离株基因组ＤＮＡ为模板,进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到预期大小的０．５５ｋｂ ＤＮＡ片段,将此ＤＮＡ片段克隆于ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ位点,筛选重组质粒,进行限制酶切分析和ＰＣＲ检测,得到含有六邻体蛋白基因片段的重组质粒,为进一步开展此病毒分子生物学研究和分     

PCR扩增乙酰乳酸合酶基因片段的研究

实验对大肠杆菌ＰＰＡＷ－１质粒的ＤＮＡ（含乙酰乳酸合酶基因）进行了提取分离与纯化,并以此质粒ＤＮＡ为模板,用乙酰乳酸合酶基因的３个引物５′－Ｂ．ｎ．、３′－ＭＷ－１和３′－Ｂ．ｎ．,通过ＰＣＲ扩增得到了乙酰乳酸合酶基因的大片段,克服了用２个引物不能扩增合成乙酰乳合酶基因的困难．     

应用光敏生物素探针检测杂交瘤及细胞中的小鼠白血病病毒

采用ＢａｍＨＩ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒ＰｓＦｌｌ中回收５ｋｂ小鼠白血病病毒（ＭｕＬＶ）ＤＮＡ片段，经光敏生物素标记后制备ＤＮＡ探针，以斑点杂交法检测杂交瘤细胞、ＭｃＡｂ纯品以及ＳＰ２／０细胞中的ＭｕＬｖ。结果表明：此探针灵敏度可达２５ｐｇ，特异性好，在被检测的１３株杂交瘤细胞和２株ＳＰ２／０细胞中分别查出５株和１株为ＭｕＬｖ阳性，ＭｃＡｂ纯品中未发现ＭｕＬｖ。     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

水稻花药特异表达基因启动子的扩增及克隆

采用ＤＮＡ聚合酶链式反应扩增技术，以水稻黄化苗总ＤＮＡ为模板成功地扩增到水稻花约特异表达基因扇动２子Ｏｓｇ６Ｂ的７７０ｂｐ和９６０ｂｐ两个片段Ｏｓｇ６Ｂａ和Ｏｓｇ６Ｂｂ。并将其克隆到ｐＵＣ１８上形成完整的Ｏｓｇ６Ｂ，这为通过基因工程方法进行水稻杂种优势利用奠定了基础。