β—内酰胺酶基因在谷氨酸产生菌T6—13染色体上的…

以质粒ｐＵＣ１３编码的β－内酰胺酶基因为外源基因，通过随机连接谷氨酸产生菌Ｔ６－１３染色体ＤＮＡ片段后转化Ｔ６－１３原生质体，使其整合到染色体上，得以表达。在实验条件下，所测１９株转化子的抗性都有很高的稳定性，其中１０株能百分之百地保持抗性。经生物素标记的ｐＵＣ１３为探针的分子杂交实验证实抗性基因已整合到Ｔ６－１３菌染色体ＤＮＡ上。     

乳酸乳球菌nisin抗性基因的克隆及作为筛选标记的研究

在添加500U/mL nisin和溴甲酚紫的GM17选择性培养基上,分离到5株nisin抗性菌株。根据形态观察,生理生化特性和16S rDNA基因序列比对被鉴定为乳酸乳球菌。根据已报道nisin抗性基因设计引物,分别以这5株菌的染色体和质粒DNA为模板进行PCR扩增,结果从1株抗性菌株的染色体上得到目的基因产物。通过序列测定和同源性比对,证明为nisin抗性基因（nsr）。将nsr基因克隆到乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pTRKH2上,重组质粒命名为pT-nsr。pT-nsr电转化乳酸乳球菌MG1614,获得的重组菌MG1614/pT-nsr在含有500U/mL nisin的培养基中生长情况良好。这表明nsr基因赋予宿主菌抗nisin特性,并且与红霉素抗性功能相同,因此nsr基因可以作为筛选标记用于食品级载体的构建。     

Paenibacillus sp. K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从鲜牛奶中分离到1株产β-galactosidase的细菌,经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillus sp. K1。提取该菌株的染色体DNA,以pUC18（lac-）为载体,构建其DNA文库;在含有X-gal的LB平板上筛选该文库,得到6个蓝色菌落;对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定,鉴定出1个编码全长为2028bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21（DE3）中,实现了β-半乳糖苷酶高效表达,其酶活为25.06U/mL,高于原始菌株的4.55U/mL,并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。     

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶基因克隆的筛选及序列分析

用改进方法提取粘质沙雷氏菌染色体DNA.通过PCR扩增,得到几丁质酶(chiA)基因,利用pUC19质粒构建了含有chiA基因的克隆载体 ,并转化E.coli DH5α.经测序分析,证明克隆片段与文献报道基本相同,仅在第437位碱基由C变为T.     

法夫酵母整合型表达载体的构建

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明:法夫酵母对20μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.     

人角质细胞生长因子-1转化番茄的研究

人角质细胞生长因子在组织的损伤修复中起着重要的作用.以番茄子叶为外植体,通过根癌农杆菌介导法,将人KGF -1导入番茄中,共获得12株独立的抗性转化植株,PCR和DNA斑点杂交结果表明:KGF-1基因整合入番茄基因组中,为获得植物源表达的KGF -1蛋白打下了基础.     

利用酵母同源重组系统克隆肺炎克雷伯菌基因组岛

利用酵母同源重组系统克隆耐药性条件致病菌肺炎克雷伯菌的基因组岛.具体方法为:对20株从临床中分离的肺炎克雷伯菌进行体外tRIP PCR扩增以搜索外源基因纽岛;利用酵母同源重组系统构建作用于arg6 tRNA基因位点的酵母捕捉载体YCV6并克隆该位点的基因组岛.结果表明:在该20株肺炎克雷伯菌中,arg6 tRNA基因位点的tRIP PCR结果都是1.2 kb,没有筛选到大基因组岛插入;所构建的酵母捕捉载体YCV6携带了2个1.8 kb的靶序列,分别与肺炎克雷伯菌arg6 tRNA基因位点两侧的保守序列同源;将线性化的载体YCV6与肺炎克雷伯菌临床株HS04044的总DNA一起转入酵母细胞,利用酵母同源重组克隆临床菌株HS04044染色体上插入arg6位点的小基因组岛.该位点特异性的捕捉载体YCV6可用于克隆肺炎克雷伯菌临床株染色体插入arg6位点的外源DNA序列.     

基于转座子策略提高链霉菌中landomycin E产量的研究

【目的】对影响放线菌链霉菌Streptomyces globisporus产landomycin E(laE)的代谢网络进行研究,以提高次生代谢物的产量。【方法】通过构建含强启动子和抗性标记的转座子Tn7为基础的转座子,整合至S.globisporus的染色体产生突变库,筛选高产量的突变株并对其代谢网络进行研究分析。【结果】利用构建好的Tn7-转座子连续转化链霉菌S.globisporus,经过数轮的突变和筛选,得到6株产量有较大改变的突变株,对整合位点的亚克隆和测序结果表明,该位点整合导致编码类似细菌的某些调节因子如TetR和GntR家族的蛋白的基因失活。【结论】所构建的经过修饰的微型Tn7-转座子不仅带有抗性标记且有启动子,可插入链霉菌染色体产生突变,进而提高次生代谢物laE的产量,同时也证明,转座子基载体可应用于非模式菌链霉菌。     

胰蛋白酶抑制剂抗虫基因转化烟草的研究

实验用携带质粒pAM194/TI的根癌农杆菌LBA4404转化烟草,通过筛选,共获得35株卡那霉素抗性苗.GUS组织染色、PCR检测及抗虫试验表明胰蛋白酶抑制剂抗虫基因已经成功地整合进再生植株染色体基因组中,有些已正确表达.     

依纽小单胞菌2-脱氧蟹肌醇合成酶基因的克隆与表达

从伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)扩增参与紫苏霉素生物合成的2-脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB,并分别将其克隆到筛选载体pUC18和表达载体pET-30a上,其开放阅读框长1 185 bp,编码含394个氨基酸残基(41.94 ku)的多肽链,将pET-sisB转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),使sisB基因实现表达.基因sisB的碱基序列与棘孢小单孢菌(M.echinospora)的基因gntB的碱基序列的同源性高达93%.预测的SisB蛋白序列与GntB蛋白序列的同源性为95.2%.基因sisB是继紫苏霉素抗性基因srm1(AY661430)和参与紫苏霉素生物合成的糖基转移酶基因sisD(DQ250992)和sisZ(DQ250994)后,从依纽小单孢菌克隆到的又一新基因.该基因在GenBank的接受号为DQ250993.     

红色糖多孢菌红霉素抗性基因的克隆与鉴定

将红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）的染色体DNA用PsTi酶切后与载体PUWL201连接，转化变沿青链霉菌（S.lividans)TK23的原生质体。采用双重抗性筛选得到了9个转化子。分别抽提其中的质粒并再次转化原生质体，在含红霉素的平板上各筛选约200个转化子，其中3个在抗性板上生长良好，分别命名为PLP42、PLP1b和PLP44。对其中的PLP42酶切分析表明，其含有约3.0Kb的红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）染色体DNA片段，它的载体部分发生了缺失。以PUC18为载体，将PLP42的1.7kb-KpnI片断克隆、测序、经与Genebank的ermE基因顺序比较，证实巳克隆了Saccharopolyspora erythraea的抗性基因。     

大熊猫肠道抗生素耐药菌质粒的研究

对分离自四川省卧龙保护区大熊猫肠道的6株大肠杆菌的抗生素抗性与质粒的关系进行了研究,结果显示：6株大肠杆菌中都存在不同大小的质粒DNA;采用SDS高温法处理每株大肠杆菌后,有2类质粒在琼脂糖凝胶上的条带数减少,菌株的抗生素抗性水平也有所降低,有2株菌的某些抗生素抗性完全消失;将分离自6株大肠杆菌的质粒转化大肠杆菌JM109,获得1个氨苄青霉素抗性转化子.这些结果表明,大熊猫肠道中的大肠杆菌的抗生素抗性与它们含有的质粒有关.     

衣藻的核基因组转化及外源基因转录分析

通过珠磨法将衣藻表达载体pSP108转入到莱茵衣藻细胞壁缺陷型CC-400藻株中,经抗性筛选及PCR鉴定,获得了24个转化藻株.在抗性基因ble编码序列的中间部位和末端部位分别设计两对不同的探针引物,运用实时荧光定量PCR对转基因藻株进行外源基因转录水平的分析.结果发现:不同转化藻株外源基因的转录水平有明显差异;同一转化藻株两对探针引物,外源基因的转录水平也存在差异.说明莱茵衣藻在转化过程中,外源基因整合到基因组上的片段数量及片段长度和完整性具有不确定性.     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina 6-22)为出发菌株,利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22-4,同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5'与3'端部分同源序列的重组质粒PD4MI6,用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基鼠的敲除.通过PEG/CaCl2介导的原生质体转化法,将质粒PD4MI6转化入深黄被孢霉M6-22-4菌株.转化子经潮毒素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6.气相色谱分析结果显示,该突变株γ-亚麻酸特征峰消失,相应地亚油酸产量显著增加.培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6-22或M6-22-4相比均有显著改变.     

利用枯草杆菌整合表达嗜铬粒蛋白抗真菌片段

为实现CGA1-76片段基因在枯草杆菌中的稳定表达,将CGA1-76片段基因的表达元件重组到枯草杆菌转座子质粒pHV1249微转座子mini-Tn10内,利用mini-Tn10将CGA1-76片段基因的表达元件整合到枯草杆菌DB1342染色体上,用氯霉素和红霉素筛选枯草杆菌转座工程菌DB1342(TnSVTQ).DB1342(TnSVTQ)在无选择压力条件下经10 d连续传代培养,转座子内氯霉素抗性丢失率为0%,说明转座子稳定整合在DB1342染色体上.SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明,在蔗糖诱导下,CGA1-76片段基因在DB1342(TnSVTQ)中获得表达,产物被分泌到细胞外.孔穴琼脂扩散法测定表达上清的抑制真菌活性,结果表明重组CGA1-76能抑制烟曲霉菌和黄曲霉菌的生长,抑菌圈直径分别为9 mm和8 mm.     

水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

栖热菌(Thermus)的DNA转化研究

由栖热菌FDB8(Thermus sp.FDB8)提取的染色体DNA对栖热菌FD3009(Thermus sp.FD3009)进行了转化.用丝裂霉素C选择培养基对转化子进行选择,共获得3个转化子.它们的菌落色泽、对丝裂霉素C的抗性强度和耐热DNA聚合酶活性均介于供体菌和受体菌之间,而其菌体生长速度和破壁难易程度则优于供体菌和受体菌.结果表明,转化子是由供体菌FDB8的染色体DNA转化了受体菌FD3009所致,同时还可由转化子进一步选育出抗丝裂霉素C的耐热DNA聚合酶高产菌株.     

粪肠球菌中具有启动功能的DNA片段的捕获及鉴定

PCR扩增来自质粒pUC119的β-内酰胺酶基因(bla)作报告基因,克隆进质粒pNZ8037上的能被Nisin诱导的启动子PnisA下游,构建了粪肠球菌启动功能片段探测载体pNZ-bla.利用该探测载体从粪肠球菌染色体总DNA中克隆到了能在粪肠球菌中表达的一系列具有启动功能的DNA片段,将包含克隆片段的pNZ-P-bla6质粒电击转化粪肠球菌,培养转化子并检测其抗氨苄强度,结果表明其抗氨苄强度大于Nisin诱导的含pNZ-bla质粒的粪肠球菌.表明克隆的功能片段启动能力强于PnisA.在pNZ-P-bla6的启动功能片段下游Sau3AⅠ和EcoRⅠ之间接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建表达绿色荧光蛋白的质粒载体pNZ-P-gfp并导入粪肠球菌中,共聚焦显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达.     

养禽场周围水环境中磺胺类抗性菌、抗性基因分布

为进行养禽场周围水环境中磺胺类抗性菌、抗性基因分布的研究,从3家养禽场多个区域水环境中分离的56株大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli),应用肉汤微量稀释法分析磺胺类药物敏感性,应用PCR方法检测磺胺类药物抗性基因。结果有18株(32.14%)磺胺类抗性菌,对利福平的耐受性最弱,对氯霉素的耐受能性最强;共检测到64个抗性基因,三个养禽场分别为:19(29.69%)、29(45.31%)、16(25.00%);分别为sul1 18(28.12%)、sul2 13(20.32%)、sul3 7(10.94%)、Int1 18(28.12%)、Int2 8(12.50%)。含一种抗性基因的菌株为1株、含2种抗性基因的菌株为1株、含三种抗性基因的菌株为6株、含四种抗性基因的菌株为5株、含五种抗性基因的菌株为4株,而1株无抗生素抗性的菌株检出抗性基因。结果表明在养禽场场内检测到抗性基因和抗性菌株数量较高、养禽场周围水环境中存在磺胺类抗性菌株,且具有多重抗性,可能对生态环境的产生一定的不良影响。