酿酒酵母金属硫蛋白的表达、纯化及活性检测

通过PCR从酿酒酵母基因组DNA上扩增得到酿酒酵母基因CUP1编码的金属硫蛋白序列.将其编码序列克隆到质粒pTWIN1构建重组表达质粒pTWIN1-MT,转化大肠杆菌感受态细胞ER2566.重组融合蛋白CBD-intein1-MT在IPTG的诱导下得到表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.用重组菌分别进行铜离子耐受...     

利用Cre-LoxP重组系统构建gdh1基因敲除的酿酒酵母重组菌

基于PCR介导的基因敲除原理,采用Cre-LoxP重组系统技术,对2倍体酿酒酵母的SS04菌株的gdh1基因进行敲除操作,构建gdh1基因完全缺失型的酿酒酵母重组菌SS17菌株,进而为后续重组酵母的乙醇代谢研究打下基础.     

酿酒酵母2B-39 sam 2在大肠杆菌中的克隆及表达

构建S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam2)的基因工程菌,为S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的工业化生产提供参考。应用PCR技术从酿酒酵母的总DNA中扩增出1.2kb的sam2,构建重组载体pET28a-sam2,将其转入大肠杆菌进行表达和分析。SDS-PAGE显示重组克隆表达的SAM2分子量约47kD,重组蛋白量约细菌总蛋白的20.1%,酶活达到19.6nmol/(h.mL),大肠杆菌表达出了具有生物活性的sam2。     

表达结核杆菌抗原的重组酿酒酵母免疫小鼠研究

近年来研究显示全细胞重组酿酒酵母疫苗具有治疗性疫苗潜能.为了研究重组酿酒酵母结核病候选疫苗的免疫效果,将IFN-γ基因与结核杆菌抗原蛋白Ag85B、ESAT6的基因融合,利用pHR酿酒酵母表达系统和同源重组方法,成功构建了以酿酒酵母Y16为宿主的表达融合蛋白IF-γ-Ag85B和IF-γ-ESAT6-Ag85B的重组酿...     

SAM合成酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

采用PCR技术从S.cerevisiae TCCC 31012菌株的染色体DNA中扩增得到S-腺苷甲硫氨酸合成酶-2基因(sam2),将sam2克隆到酿酒酵母表达载体pACT2的强启动子PADHI控制下,以构建高效表达质粒,并在酿酒酵母亮氨酸缺陷型茵株YS58中表达.重组质粒经鉴定含有sam2基因.工程菌YS58-2表达产物经SDS-PAGE,结果显示重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的分子质量约为43ku,经凝胶电泳扫描,表达带约占菌体总蛋白的14%.YS58-2菌株培养72 h的SAM合成酶活力为16.5 U/mg茵体蛋白,较出发菌S.cerevisiae TCCC 31012提高了40.3倍,较受体菌YS58提高了32倍.     

一种酿酒酵母同源重组载体的筛选

将携有mTn-3xHA／LacZ转座子的酿酒酵母文库质粒pHSS6转化大肠杆菌DH5α,挑取单菌落并提取其质粒．将纯化质粒分别用Not Ⅰ酶切后,转化尿嘧啶缺陷型(ura^-)酿酒酵母菌株INVScl,使其同源重组到酿酒酵母基因组中,于SC／ura^-平板上筛选．取长有单菌落酵母的平板进一步筛选重组后上游有强启动子酿酒酵母文库质粒,用近300个质粒转化酵母菌株INVScl,最终得到2株前端有强启动子的酿酒酵母质粒,这2个质粒可作为酿酒酵母同源重组载体广泛应用．     

甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

利用DNA重组技术，将杆状病毒极早期基因iel启动子基因克隆至重组质粒pGEM-Se39中，成功地构建了重组真核表达质粒pGEM-IE1-Se39。     

木糖发酵重组酿酒酵母研究进展

近年来针对木质纤维素类原料生物转化乙醇的研究引起了广泛关注。乙醇的高产依赖于木质纤维素水解液中六碳糖和五碳糖的共同发酵。但是,传统产乙醇酵母酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 既不能发酵木糖, 也不能利用该五碳糖生长。因此, 研究人员尝试各种方法构建重组酵母菌以提高木糖发酵能力。作者综述了木糖发酵重组酿酒酵母菌的研究进展,包括天然木糖发酵微生物、木糖代谢途径、S. cerevisiae 的代谢工程、原生质体融合以及基因组改组技术, 同时也对目前研究存在的问题及研究前景进行了讨论。     

酵母克隆基因的转化和稳定性检测

采用放射性探针分子杂交技术鉴定及选出重组DNA的可靠转化子。实验结果表明:双倍体受体的转化效率约为单倍体的2倍;含有酵母染色体端粒区GT重复顺序的重组质粒的转化效率约为含染色体内部区GT重复顺序重组质粒的3倍;在克隆基因的稳定性方面,整合型转化子要比自主复制型转化子高得多。因此,用酿酒酵母作基因工程生产菌时以双倍体为好。经分析并证实,含酵母染色体端粒区GT重复顺序的重组子有些具有多靶整合作用,这种整合转化在基因工程中有实用价值。     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

High-frequency transformation of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, has been used extensively for genetic studies but until now it has not been utilized as a host organism for DNA cloning. Here we describe a method for high-frequency transformation fo a leu 1(-) strain of this yeast with hybrid plasmids containing the Saccharomyces cerevisiae LEu 2(+) gene, a bacterial plasmid and either the S. cerevisiae 2 μm plasmid or autonomously replicating sequences (ars)(1) derived from S. pombe DNA. Some of the plasmids contain unique restriction sites which make them suitable for the isolation of S. pombe genes, and they can also be used for the exchange of DNA between S. pombe and S. cerevisiae.     

Primary structure homology between the product of yeast cell division control gene CDC28 and vertebrate oncogenes

In the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, division is controlled in response to nutrient limitation and in preparation for conjugation. Cells deprived of an essential nutrient or responding to mating pheromones cease division and become synchronous in the G1 interval, apparently constrained from completing a critical event. This event has been given the operational designation of 'start'. We have isolated a large number of start mutations which confer on S. cerevisiae cells a conditional inability to complete start (Fig. 1) presumably because they define genes which must be expressed for the start event to be successfully completed. We have described the isolation on plasmids of one of the start genes, CDC28, by genetic complementation and initial characterization of its product. We now describe the DNA sequence of the gene CDC28.     

一种高效的酿酒酵母和毕赤酵母电击转化法

 电击转化由于其高效率而被广泛地应用于酿酒酵母的转化过程中。但是由于菌种退化或是暴露于污染的环境,很多菌种的转化效率会显著地下降2~4个数量级。探索了一种改进的电击转化方法,它借助于单链载体DNA和转化后在YPD培养基中的复苏过程,可以使转化效率比之前曾报道过的已经最优化的用醋酸锂和二硫苏糖醇进行预处理的转化方法效率提高13倍。在毕赤酵母中使用这一改进的方法,可以使转化效率提高高达114倍,在一些已经退化的酿酒酵母菌株中,此方法也可以提高转化效率将近100倍。这一方法将为几乎所有酿酒酵母和毕赤酵母的分子操作提供极大的便利。     

基于酵母基因组高通量数据的基因-基因相互作用预测

后基因组时代的显著特点是大规模基因组和蛋白质组实验平台所产生的大量高通量数据,整合并利用基因组和蛋白组信息成为这一时代的主要挑战之一. 因此,基因-基因相互作用将有助于理解细胞内基因之间的相互作用以及信号传导通路研究提供有价值的参考. 为预测酵母基因组中基因-基因相互作用,我们利用高通量数据中的蛋白-蛋白相互作用、遗传表型数据、基因微阵列表达数据以及功能基因注释数据等来分析酵母中的基因-基因相互作用. 本文建立的预测方法为在系统水平上理解酵母基因组中的基因功能提供了依据,也为揭示酵母基因组中的基因-基因相互作用网络奠定理论基础.     

匍匐茎草本蛇莓RAPD反应体系优化

为了建立蛇莓RAPD反应的最佳反应体系,我们对每个反应因子进行优化研究。在本实验室常用的RAPD反应体系的基础上,根据RAPD扩增效果确定蛇莓基因组DNA的最佳RAPD反应体系。经优化后,我们建立了适合蛇莓的最佳RAPD反应体系:25μL反应体系中含10×Buffer 2.5μL,2 mmol/L Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,50 ng模板,0.22 mmol/L dNTPs,0.35μmol/L随机引物S30。本研究结果为下一步野生蛇莓遗传多样评估奠定基础。     

ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.

A multiprotein complex that specifically recognizes cellular origins of DNA replication has been identified and purified from the yeast Saccharomyces cerevisiae. We observe a strong correlation between origin function and origin recognition by this activity. Interestingly, specific DNA binding by the origin recognition complex is dependent upon the addition of ATP. We propose that the origin recognition complex acts as the initiator protein for S. cerevisiae origins of DNA replication.     

自溶链霉菌遗传操作研究

放线菌新种自溶链霉菌能够产生一种称为自溶霉素的抗肿瘤活性产物.虽然自溶霉素具有成为抗肿瘤药物的良好前景,但是自溶链霉菌遗传操作方法的缺乏严重阻碍了对自溶霉素生物合成的研究.本工作对自溶链霉菌中各种遗传操作方法进行了探索.优化了PCR扩增的反应体系和程序,建立了外源DNA导入的方法,确立了构建基因敲除突变株的最佳方案.此外,也摸索了自溶霉素发酵和HPLC检测的适宜条件.利用所建立的方法对自溶链霉菌基因almRⅠ和almRⅡ的功能进行了初步研究,结果表明它们在自溶霉素生物合成过程中起正调控作用.自溶链霉菌遗传操作方法的建立为进一步开发利用放线菌资源奠定了基础.     

综合教务管理信息系统的开发

教务教学管理已经实现了计算机信息管理,但都处于单机管理状态,仅供本部门使用,无法实现信息的高效共享,需要开发出一整套教务管理信息系统进行综合教务管理.新的教务管理信息系统采用了当前流行的C/S结构和Internet网络技术,因而就可在多地域、任意时间段以不同身份来访问教务系统中的数据,大大加强了系统数据共享的能力.新系统的使用,为促进学校教务管理的科学化、规范化、信息化、减员增效、保障学分制的顺利实行提供了有力的支持.     

Genetic linkage studies suggest that Alzheimer's disease is not a single homogeneous disorder. FAD Collaborative Study Group

Alzheimer's disease, a fatal neurodegenerative disorder of unknown aetiology, is usually considered to be a single disorder because of the general uniformity of the disease phenotype. Two recent genetic linkage studies revealed co-segregation of familial Alzheimer disease with the D21S1/S11 and D21S16 loci on chromosome 21. But two other studies, one of predominantly multiplex kindreds with a late age-of-onset, the other of a cadre of kindreds with a unique Volga German ethnic origin, found absence of linkage at least to D21S1/S11. So far it has not been possible to discern whether these conflicting reports reflect aetiological heterogeneity, differences in methods of pedigree selection, effects of confounding variables in the analysis (for example, diagnostic errors, assortative matings), or true non-replication. To resolve this issue, we have now examined the inheritance of five polymorphic DNA markers from the proximal long arm of chromosome 21 in a large unselected series of pedigrees with familial Alzheimer's disease. Our data suggest that Alzheimer's disease is not a single entity, but rather results from genetic defects on chromosome 21 and from other genetic or nongenetic factors.