拟南芥ACOS5基因启动子的克隆和表达载体构建

花药组织特异性启动子在花药发育的分子遗传学中有重要的研究价值.采用PCR方法克隆了1kb长度的ACOS5基因启动子,并将其连入含有GFP基因的拟南芥表达载体p1300中.电激转化农杆菌GV3101后,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因植株.显微观察显示,转基因植物花药只在绒毡层中有荧光表达.这说明ACOS5基因启动子可以在拟南芥花药中驱动外源GFP基因的特异性表达.     

拟南芥HSP70基因启动子表达载体的构建及在烟草BY2细胞中的应用

探讨了拟南芥的HSP70基因在液体悬浮培养的烟草BY2细胞中的表达及应用.用PCR扩增的方法从拟南芥col生态型基因组中扩增获得HSP70基因启动子序列,将其连入p1300表达载体且以GFP为报告基因,将该表达载体采用农杆菌转基因转入液体悬浮培养的烟草BY2细胞中,观察转基因细胞中报告基因GFP的表达情况.结果显示:HSP70:GFP转基因液体悬浮培养的烟草BY2细胞中有GFP的表达.该表达载体可在液体悬浮培养的BY2细胞中正常表达,且可在较短时间内获得大量实验材料,对拟南芥的HSP70基因启动子的进一步研究提供理论依据和丰富的实验材料,且可明显缩短实验周期.     

拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究

探讨了拟南芥的翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位.以Col野生型拟南芥的cDNA为模板,通过高保真KOD扩增酶获得2 363bp的拟南芥转录延伸因子EF1A基因片段,将其与GFP融合后共同连入p1300表达载体,利用农杆菌侵染法将p35S∶GFP和p35S∶EF1A∶∶GFP转入野生型拟南芥中,观察转基因植物细胞中GFP的表达情况.结果显示:p35S∶GFP转基因植物中,细胞核中GFP荧光强度显著高于细胞质中荧光强度,但是在p35S∶EF1A∶∶GFP转基因植物中,细胞核中荧光强度与细胞质中荧光强度无显著差异,说明在进行蛋白翻译时细胞质中的EF1A含量显著高于细胞核中,这也为翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位提供了实验依据.     

水稻中ACOS5同源基因在小穗中的表达分析

ACOS5是控制拟南芥雄性育的关键基因之一,它也是编码花粉素合成必需的酶.利用氨基酸同源序列分析,在数据库中检索与拟南芥ACOS5同源性较高的植物同源蛋白.将检索出的水稻中同源氨基酸序列与ACOS5进行比对,两者一致性为64%.并且通过同源蛋白系统发生分析,两者在进化上关系也较为密切.根据水稻中同源蛋白基因组序列设计引物,进行低温处理下该基因在小花发育各时期的表达量分析.半定量RT-PCR显示,在水稻小孢子母细胞形成期其表达量较低,而当小孢子开始减数分裂时,表达量急剧增高.在这两个时期,低温(20℃)会诱导OsACOSmRNA积累增加;但当处于小孢子形成阶段时,低温下积累量却呈现相反的降低趋势.这说明环境温度显著影响水稻中ACOS5同源基因的转录表达,而这种影响与小花发育时期有关,提示水稻ACOS基因可能参与环境温度调控水稻雄性育性的过程.     

NAC1启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NAC1上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NAC1启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达.进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导.初步说明NAC1基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因.     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

NACl启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NACl上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NACl启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达．进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导．初步说明NACl基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因．     

拟南芥AAP6基因的克隆与转化马铃薯的研究

氨基酸透性酶(AAP)是植物中的氨基酸转运蛋白,在氨基酸转运过程中发挥着重要作用.以野生拟南芥(生态型col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆得到拟南芥中的氨基酸透性酶基因(At AAP6).该基因全长1,446,bp,构建At AAP6基因的植物表达载体pCAMBIA2300-At AAP6,并利用农杆菌介导的遗传转化方法在马铃薯品种"早大白"中异源过表达At AAP6基因.经过抗性筛选与植株再生,成功得到马铃薯转基因植株,并诱导得到转基因马铃薯微型薯.RT-PCR结果表明,At AAP6基因在转基因马铃薯中都能正常地转录表达.这一研究为进一步开展At AAP6基因功能验证,提高马铃薯块茎中的氨基酸以及贮藏蛋白的含量提供了研究基础.     

多基因双T-DNA植物表达载体的构建及拟南芥转化

多基因植物表达载体用于植物遗传转化是培育具有多种优良品质作物的有效策略. 双T-DNA系统是实现筛选完成后选择标记基因删除的一种简便可行的方式. 为培育高度抗逆或去除标记基因的农作物,构建了多基因双T-DNA植物表达载体2T-bbgdD,其中含有一个抗除草剂基因bar, 3个抗逆相关基因(DREB1A, Na+依赖性Pi转运体基因（d5）, betA)和一个报告基因gfp. 利用农杆菌介导法将该载体转入拟南芥,获得了多基因共转化及去除标记基因的转基因拟南芥. 可将此植物表达载体进一步用于作物的遗传转化.     

通过转基因途径获得植物雄性不育

对利用转基因的方法获得植物雄性不育的研究进展进行了概述 .小孢子发育过程涉及花药发育到花粉粒成熟过程中一系列基因的表达 .这些基因表达的异常往往导致部分或全部的花粉败育 .利用绒毡层特异性启动子或花药特异性启动子驱动一种外来基因的表达可以导致雄性不育 .育性的恢复也可通过转基因技术来实现 .控制植物育性的基因工程将在优势育种中发挥越来越重要的作用 .     

Osmotically stress-regulated the expression of glutathione peroxidase 3 in Arabidopsis

Gene expression of glutathione peroxidase 3 (ATGPX3) in response to osmotic stress was analyzed in Arabidopsis using ATGPX3 promoter-glucuronidase (GUS) transgenic plants. High levels of GUS ex- pression were detected under osmotic stress in ATGPX3 promoter-GUS transgenic plants. Compared with the wild type, the growth and development of ATGPX3 mutants (atgpx3-1) were more sensitive to mannitol. In addition, the expression of RD29A, ABI1, ABI2 and RbohD in atgpx3-1 was induced by ABA stress. These results suggest that ATGPX3 might be involved in the signal transduction of osmotic stress.     

一个水稻蛋白激酶的过表达分析及表达调控

对一个预测的具有光反应活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK进行过表达研究,构建了STK过表达载体,并用农杆菌介导的方法进行遗传转化,获得T0代转基因植株.对转基因阳性植株进行表达分析的结果表明,转基因植株STK基因的表达量显著高于对照,说明目的基因得到了过表达.另外,利用获得的过表达转基因植株对STK调控水稻中光周期相关的开花基因Hd1和Hd3a的表达进行分析,结果表明,Hd1及Hd3a的表达在转基因植株中明显上调,表明该蛋白激酶的基因可能位于Hd1和Hd3a上游,对于Hd1和Hd3a的表达具有重要的调控作用.     

棉花DELLA蛋白GhGAl4a基因在拟南芥中功能初步分析

为了探究棉花DELLA蛋白基因GhGAI4a在拟南芥中的功能,构建植物表达载体pBP35S：GhGAI4a和pBP35S：Ghgai4a,利用农杆菌介导的花滴法将其转入Col野生型拟南芥。结果显示,2个载体各自获得6个独立的转基因拟南芥纯合株系。分别统计48—96h种子萌发率,测量生长7d后幼苗的主根长度,与非转基因植株相比,过量表达GhGAI4a、Ghgai4a对拟南芥种子萌发及主根生长具有明显的抑制作用。1μmol／LGA处理转基因植株,GhGAI4a转基因植株主根长和萌发率均增大,而Ghgai4a转基因植株主根长度和萌发率均无显著变化。     

慢病毒载体转染犬睾丸生殖细胞

摘要: 目的观察慢病毒载体( Lentiviral vector,LV) 对犬生殖细胞的转染,为基于LV 的精子介导法制备转基因动 物提供依据。方法采用睾丸打点注射法,向比格犬两侧睾丸分别注入滴度为5 × 108、1 × 108、2 × 107 TU /mL 的 慢病毒液组成3 个剂量组,每点注射量为每只犬0. 2 mL。于注射后第2 周开始采集精液,通过精液DNA 的PCR 检 测和精子荧光镜检评估绿色荧光蛋白( green fluorescent protein,GFP) 基因的整合及表达。结果1) 在高剂量组,整 合并表达GFP 基因的精子于第4 周首现并持续至第17 周; 在中、低剂量组于第5 周首现,分别持续到第14 周、12 周。2) GFP 表达的高峰期在注射后第7 周～ 10 周。3) GFP 表达于整个精子,以顶体后区和精子尾颈部表达最强。 4) 注射后第2 周～ 6 周,中剂量组犬采精困难,高低剂量组犬精子畸形率有上升的趋势。5) 在GFP 表达的高峰期, 绿色荧光精子的百分率在高、中、低剂量组分别为43. 33% 、35. 53% 和4. 55% ,具有明显的差异。结论基于LV 的 精子介导转基因法( Sperm-mediated gene transfer,SMGT) 可成功获得转基因犬精子,转基因阳性率、表达的强度与 持续时间与慢病毒滴度相关。     

拟南芥AtPLC4基因RNAi载体的构建及遗传转化

利用RNAi技术,构建了AtPLC4基因的RNAi双元载体,并进行了拟南芥的遗传转化,通过抗性筛选及PCR鉴定,获得20株遗传转化株系.进一步通过RT-PCR检测,得到3株AtPLC4基因表达降低的转基因植株,为运用反向遗传学的方法深入研究AtPLC基因家族的生物学功能提供基础.     

拟南芥AtHHR3响应热胁迫应答的初步分析

拟南芥基因AtHHR3编码一个RING结构域的E3连接酶,通过生物信息学分析发现其可能参与植物热胁迫相关的应答.为了探索其具体的功能,构建了AtHHR3互补株系,并在DNA水平和转录水平分别鉴定了AtHHR3互补株系,用RT-PCR技术分析了AtHHR3在热处理条件下基因表达的变化情况.在热胁迫下分析了野生型、突变体athhr3、回复株系幼苗存活以及种子萌发的表型变化情况,发现突变体athhr3表现出对热胁迫的耐受性,并检测了热胁迫下不同株系的HSF、HSP等热相关基因的转录水平的变化,初步的研究表明拟南芥基因AtHHR3负调控植物对热胁迫的耐受性.