中间苍白杆菌尼古丁降解相关基因ocnH的克隆及功能分析

通过PCR扩增获得中间苍白杆菌SCUEC4菌株中与尼古丁降解相关的ocnH基因,构建重组质粒pET28a(+)-ocnH,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,并对表达条件进行优化,用高效液相色谱法测定重组表达菌株的马来酸异构酶活性.结果表明：ocnH基因大小为585 bp,编码蛋白分子量约为20.6 kDa.重组表达菌株在IPTG浓度为0.6 mmol·L^-1、诱导温度为25℃、诱导表达时间为20 h时,OcnH蛋白的表达量较高.转入pET28a(+)-ocnH的大肠杆菌BL21(DE3)菌株具有将马来酸转化为富马酸的功能.     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。     

H4菌株对环己烷的降解性能

为了应对石油污染问题,研究获得高效降解石油烃菌株.分析高效降解菌株H4的降解性能,确定了H4菌株对环己烷的最佳降解条件,在环己烷初始质量浓度为2.49 g/L,培养温度为28℃,pH为6,液体培养基菌体浓度约为9×105个/mL,液体培养基体积为100 mL,摇床转速为120 r/min的条件下,环己烷96h的降解率为70.1％.     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆、表达及杀虫活性分析

选择本实验室分离的野生型苏云金芽孢杆菌菌株WY-197为出发菌株，用全长PCR方法从此菌株中克隆了2．3kb大小的vip3A基因,DNA序列比较发现所克隆的基因vip3A-197与已知的营养期杀虫蛋白基因存在很高的同源性．将基因vip3A-197亚克隆至原核表达载体pET33b构建了原核表达质粒pEVip，转化大肠杆菌BL21，转化子经IPTG诱导后可表达88kD大小的蛋白．该蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)棉铃虫(Helicoverpa armigera)的初孵幼虫进行生物测定，结果表明，营养期杀虫蛋白vip3A-197对夜蛾科害虫具有一定的杀虫活性。     

灵芝免疫调节蛋白LZ-8基因的克隆与表达

灵芝能够调节和增强机体免疫力,具有极高的药用价值;LZ -8蛋白是最早被分离研究的免疫调节蛋白,它不仅是灵芝生命活动的重要物质而且具有独特免疫原性.实验采用CTAB法提取灵芝基因组DNA,PCR扩增全长lz -8基因;利用XbaⅠ,XhoⅠ位点将lz -8编码基因片段克隆到原核表达载体pET -28a中,构建原核重组表达质粒pET -lz8,转化BL21(DE3)并进行SDS - PAGE及Western - blot分析.结果表明:克隆的lz -8基因与GenBank报道的序列同源性达到87.5%～100%;重组菌株经IPTG诱导后,lz -8基因得到了高效表达,目的蛋白表达量可达菌体总蛋白的36.52%.     

黄杆菌（Flavobacterium sp.）ATCC27551 opd基因在E.coli中的克隆及表达

研究了黄杆菌ATCC27551的opd基因在大肠杆菌中的表达,并对于表达产物进行了胞内定位和酶活测定,通过PCR扩增和PCR产物直接克隆,将黄杆菌质粒上的一段长达1137bp和opd基因进行扩增及克隆,然后按正确的读码框亚克隆于表达载体pET28b（ ）上,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导,获得了较高量的基因表达产物,该表达产物以包涵体的形式存在于细胞内,通过分离包涵体可以得到电泳较纯的条带,工程菌的细胞活性达到原始菌株黄杆菌的水平。     

绵羊ISG15基因的克隆表达与纯化

为了克隆并表达绵羊ISG15,且对其表达产物进行纯化,首先从绵羊外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ISG15的基因;再通过基因克隆技术,构建ISG15在pET28a中的重组表达质粒pET28a-ISG15,在大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,得到ISG15的原核表达蛋白;最后采用Ni 2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白。结果显示:克隆的绵羊ISG15基因序列长度为541bp,编码157个氨基酸。重组表达产物通过SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25ku的重组蛋白,且表达的目的蛋白能被Ni 2+-NTA亲和层析方法所纯化。该研究为后续深入研究绵羊ISG15奠定基础。     

节杆菌AD1菌株的阿特拉津氯水解酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从节杆菌AD1菌株中扩增出完整的阿特拉津氯水解酶基atzA，该基因与载体pGEM-T连接成重组质粒以后，转化大肠杆菌DH5a，表达出了有活力的阿特拉津氯水解酶。     

盐生盐杆菌含耐盐相关基因DNA片段的克隆

将盐生盐杆菌总DNA的BamHI不完全酶切片段与质粒pUC19连接成重组质粒,并以重组质粒转化E.coli JM101.经X-Gal-IPTG法筛选白色重组子,结合高盐平板检测,已经获得了3株比原受体菌的耐盐性提高30％－67％的转化子。重组质粒酶切电泳分析表明,被克隆的盐生盐杆菌含耐盐相关基因的DNA片段长度在1．0－3．5kb之间。     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒蛋白基因VirD1的克隆及原核表达

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1蛋白表现拓扑异构酶活性,能解除T-DNA边界处25bp重复序列的超螺旋状态,使外源基因的插入成为可能.本实验以C58菌株为模板,设计了一对含有BamHI和XhoI酶切位点的引物,成功克隆了VirD1基因,并构建了原核表达载体pET30a-VirD1,将其在宿主菌BL21中获得了表达,为将来构建含有VirD1基因的植物表达载体并协助目的基因转化奠定基础.     

人血管生成素基因的克隆及表达

利用RI-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段,测序正确后克隆入表达载体pET-28a( )中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导,表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2 高亲和力结合的性质,经镍柱纯化,获得了高纯度的血管生成素融合蛋白,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

青稞脱水素基因dhn4的克隆与原核表达

用RT-PCR的方法从重要的高原作物青稞(Hordeum vulgare L.vat.nudum Hook.f.)中克隆到了脱水素基因dhn4,其编码区长为678 bp,所编码的蛋白质DHN4为YSK2型脱水素.经预测,该蛋白二级结构易形成α-螺旋,并无固定的三级结构.将dhn4基因cDNA编码区定向克隆到载体PEW30-c上,获得了重组质粒PET-dhn4,该重组质粒再转化到大肠杆菌BL21茵株,37℃经1.5 mmol/L IPTG诱导获得了大量分子量约为35 kD的融合蛋白.然后用亲和层析的方法对该蛋白进行纯化,得到了纯化的脱水素DHN4蛋白.     

菠菜43 kD叶绿素a结合蛋白编码基因克隆及原核表达条件优化

将菠菜43 kD叶绿素结合蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-psbC转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导实现了外源基因的可溶性表达.探讨了含组氨酸标签融合蛋白的最佳表达条件(包括表达单克隆、时间、温度对表达的影响).利用Ni2+-Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出His-apo CP43蛋白.体外重组实验证实 His-apo CP43能特异结合叶绿素a,经过温和电泳分离纯化所得体外重组色素蛋白复合物具有与提取自类囊体膜的天然CP43相似(但不完全相同)的荧光特性.     

中华鳖dct基因克隆及表达分析

为了阐明中华鳖酪氨酸酶家族成员dct基因的结构与表达特征,根据Ensembl数据库的中华鳖dct基因序列设计引物,运用RT-PCR技术进行开放阅读框(opening reading frame,ORF)克隆,并进行生物信息学分析,进而采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-PCR)技术检测正常体色和黄色中华鳖肺、肾脏、裙边和肌肉组织的mRNA表达水平.结果显示中华鳖dct基因ORF区全长1 578 bp,编码525个氨基酸,2种体色鳖dct基因序列完全一致;氨基酸序列分析得C末端无L-亮氨酸基序;N末端含有1个信号肽结构域;预测蛋白(成熟肽)分子质量为56.449 ku,理论等电点为6.67,不稳定指数为38.71,表明DCT蛋白是酸性稳定蛋白;预测DCT蛋白为亲水性蛋白;含有跨膜结构域、类表皮生长因子结构域、层粘连蛋白型类表皮生长因子结构域和2个铜离子结合结构域.系统发育树分析显示,在dct基因进化过程中,中华鳖与绿海龟和锦龟的亲缘关系较近.q-PCR结果表明:dct基因在同一个体各组织中均有表达,肺组织中相对表达量最高,且极显著高于其他3种组织;黄色中华鳖肺、肾脏和裙边组织dct 表达水平与正常体色鳖的相应组织均存在显著性差异.结果表明,中华鳖体色变异与dct基因突变无关,但dct基因表达改变可能对体色变异起了一定的作用.     

人乳铁蛋白基因克隆及表达载体构建

通过ＰＣＲ法扩增出２３６６bp的人乳铁蛋白cDNA、８００bp的山羊β－乳球蛋白基因５′端调控序列,经ＰＣＲ反应连接后,克隆到表达载体pLNCX中,测序结果表明,与ＧeneBank中登录的序列相比,所获人乳铁蛋白cDNA序列的同源性为９９．７４％,山头β－乳球蛋白基因５′端调控序列的同源性为９９．７５％。酶切结果证明得到了正确的重组载体,可用于乳腺生物反应器的研究。利用ＰＣＲ反应直接克隆目的片段,并通过同源序列进行ＰＣＲ连接,极大提高了克隆的速度和准确性,,为基因克隆及其表达研究带来了方便。     

柽柳 GF14基因的克隆与表达分析

生物体中普遍存在的14-3-3蛋白(也称GF14蛋白)能够参与植物的一系列应激响应过程。笔者以柽柳(Tamarix hispida)为材料,从6个柽柳cDNA文库中分离出5条GF14 基因,依次命名为ThGF14a—ThGF14e。对5条GF14 基因进行生物信息学研究,并利用qRT-PCR技术对胁迫处理后的基因表达模式进行分析。结果显示:ThGF14 蛋白除了N和C末端的氨基酸外均含有一个高度保守的14-3-3 结构域,这些ThGF14蛋白分属于ε-like 和 non-ε 两种类型; 大多数 ThGF14基因在NaCl、PEG、4 ℃、CdCl₂处理不同时间(6,24,48 和 72 h)的叶和根中能够被诱导表达(表达量>2倍),且不同基因间对非生物胁迫应答表现出差异,其中ThGF14c 基因在叶和根中不同胁迫条件下的表达水平均最高。研究表明,柽柳 ThGF14 基因能够参与植物的非生物胁迫应答响应过程。     

重瓣百合LiSEP3基因克隆与表达分析

【目的】克隆百合LiSEP3基因并确定其在百合不同地上器官及不同花瓣中的表达差异,探讨SEP3基因在重瓣花中的表达模式。【方法】利用RACE方法从重瓣百合品种‘比罗尼卡’中克隆得到LiSEP3基因核苷酸序列,利用SMART软件对其蛋白结构进行分析,以MEGA 5.0软件进行系统进化树分析,用基因枪轰击法进行亚细胞定位分析,采用荧光定量PCR进行不同地上器官及不同花瓣中LiSEP3基因表达差异分析。 【结果】LiSEP3基因属于MADS-box家族E类基因,其开放阅读框为729 bp,共编码242个氨基酸; LiSEP3基因编码的蛋白具有典型的MADS结构域、K-box区及2个SEP基序; LiSEP3与同为单子叶植物的六出花的SEP3亲缘关系最近; LiSEP3蛋白定位于细胞核中; LiSEP3基因在花中的相对表达量最高,在茎、叶中几无表达; 在1～7轮花瓣中均能检测到LiSEP3表达,且位于最内侧的第7轮花瓣中相对表达量最高。 【结论】LiSEP3基因属于MADS-box家族E类基因,主要在花中表达,其中在最内侧花瓣中表达量最高,其表达模式与双子叶植物花中SEP3基因表达模式存在不同。     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

家蚕促咽侧体素受体基因克隆及发育表达

文章克隆得到家蚕(Bombyx mori)神经肽促咽侧体素受体基因(Allatotropin receptor,BommoATR),开放阅读框全长为1 254 bp,编码416个氨基酸.Bommo-ATR氨基酸序列的二级结构预测为7次穿膜蛋白,符合GPCR家族成员的典型特征.实时荧光定量PCR结果表明,家蚕脑-咽下神经节复合体中的ATR mRNA在5龄幼虫期表达量最高,其次为蛹后期,蛹前期和成虫阶段表达量最低.其中5龄幼虫第2天表达量最高,1～5 d持续维持较高的表达水平,这可能与保幼激素的合成有关.     

青杄PwWrbA基因克隆及表达分析

色氨酸阻遏结合蛋白(tryptophan repressor-binding protein,WrbA)是一种重要的抗氧化酶类,参与了多种逆境反应。笔者通过RACE-PCR的方法克隆得到青杄WrbA基因的cDNA全长,共1 045 bp,编码区651 bp,编码203个氨基酸。利用生物信息学工具对其进行理化性质、二级结构和三级结构的分析,该蛋白理论分子质量21.80 ku,pI值6.43,N端11—15位氨基酸和C端112—165位氨基酸是FMN结合位点。荧光定量PCR和半定量RT-PCR发现青杄PwWrbA在各组织中都有表达,但在针叶中表达量最高。同时,PwWrbA在NaCl和ABA胁迫处理后表达量升高,H₂O₂也会影响其表达的改变,H₂O₂处理6 h后表达量上调。因此,PwWrbA是一个新的WrbA基因,推测其可能在青杄逆境胁迫应答中发挥作用。