不同方法提取鳗鲡病原茵DNA模板的差异分析

利用吸光值、琼脂糖电泳及PCR差异扩增等指标,对酚一氯仿法、水煮法、碱裂解法3种方法制备的鳗鲡病原菌DNA模板进行了差异分析．结果表明：1）不同方法提取的病原菌模板DNA的浓度、纯度及分子质量大小存在差异,但以这3种方法提取的病原菌DNA为模板,均能成功扩增到细菌16SrD．NA和外膜蛋白的保守序列．其中,酚一氯仿提取的模板DNA浓度较低、纯度较高;水煮法和碱裂解法提取的模板DNA浓度较高、纯度较低．2）电泳显示,3种方法获得的模板DNA扩增出的16SrDNA保守序列条带均一,没有显著差异,但在外膜蛋白保守序列的扩增中却因菌种和模板提取方法的不同而存在差异．     

利用微波炉和煮沸法快速制备大肠杆菌基因组DNA PCR模板

利用微波炉和煮沸法可以简单、快速、有效地制备大肠杆菌基因组DNA PCR模板.用该模板做PCR具有很高的效率和良好的特异性.     

真菌DNA提取方法的改良

 介绍一种快速有效的提取真菌DNA的方法.用此方法提取了不同属真菌、酵母菌的DNA,均获得比较满意的结果.并用所提取的DNA作模板扩增,得到了可用作测序的PCR产物.     

利用重叠延伸PCR技术扩增长片段DNA

重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的DNA基因片段的方法.该技术可以高效、快捷、经济地扩增长片段DNA,在基因功能研究方面显示出良好的应用前景.综述了重叠延伸PCR技术的原理、特点以及利用该技术构建长片段DNA的方法和注意事项,并对该技术的应用前景进行了展望.     

羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物高效分离基因组DNA

分别以常量的大肠杆菌和微量的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)为实验对象,研究羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物载体对基因组DNA的分离纯化,对分离的大肠杆菌基因组DNA直接采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析,分离的A.ferrooxidans基因组DNA则直接作为硫化物质体醌氧化还原酶基因片断的PCR扩增模板.研究结果表明:采用磁性纳米复合物法,其制备DNA的时间是传统方法的1/3,具有快速、简单的优点,在微量样品DNA提取中,由于其富集提取DNA,并提高了PCR的灵敏性功能,比传统方法优越,可用于食品卫生致病微生物的检测、法医鉴定以及极难培养的微生物的菌种鉴定.     

唇鱼骨基因组DNA提取与ISSR-PCR的优化

以唇鱼骨为材料,分别采用4种不同方法(CTAB法、SDS法、ROSE法及试剂盒)提取基因组DNA,并对影响PCR反应的模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶浓度等主要因子进行了优化,建立了适合唇鱼骨基因组DNA的ISSR-PCR反应体系.25μL的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:约60 ng模板DNA,1.2 U Taq酶,0.4 μrnol/L引物,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,2%甲酰胺.结果表明,利用优化反应体系对4种不同方法提取的DNA进行PCR扩增,均能得到较好的PCR扩增条带,以试剂盒法最佳,为淡水溪流性同属鱼类遗传多样性分析奠定了技术基础.     

一种适用于批量筛选和鉴定拟南芥突变体的快速DNA提取方法

DNA提取是拟南芥突变体筛选与鉴定中的关键环节.结合拟南芥突变体鉴定特点和DNA提取特点,对传统SDS法进行改良,摸索出一种简易、快速且经济的DNA提取方法,并将其应用到突变体的批量筛选与鉴定中.使用该方法可在常温下利用10mg左右拟南芥叶片,以少量试剂,通过简单的研磨、离心、沉降和干燥等步骤便能快速制备用于PCR检测的DNA模板.采用本方法个人提取单个样品DNA仅需15min左右,每小时可提取48个DNA样品.研究采用该方法提取了一批待鉴定拟南芥突变体的DNA样品,利用三引物法对其进行PCR检测,结果表明DNA样品浓度高,DNA扩增成功率高达100%,且目的条带清晰,说明该方法在拟南芥突变体的筛选和鉴定上是适用且高效的,可广泛应用于实验室突变体库的建立.     

内蒙古荒漠草原土壤微生物DNA提取方法的研究

利用三种提取方法从内蒙古荒漠草原土壤样品中提取了土壤微生物DNA,得到的DNA片段长度在23 kb以上,提取效果较好无降解.采用试剂盒直接纯化、凝胶回收试剂盒纯化、玻璃珠DNA回收试剂盒SK1111 DNA纯化这三种方法对粗提液进行纯化,结果显示:凝胶回收试剂盒纯化后DNA纯度最高,试剂盒直接纯化可得到较纯的DNA,而玻璃珠DNA回收试剂盒SK1111 DNA纯化的效果不佳,不宜进行后续的PCR扩增.以纯化的土壤微生物DNA为模板扩增了细菌16SrDNA,扩增产物分子量为1.5kb左右.通过比较研究提出了一种适合于从荒漠草原土壤中进行微生物DNA提取、纯化及PCR扩增的有效方法.     

微小病毒TLMV的检测研究

目的 TLMV是一种新型与输血性肝炎相关的人类DNA病毒,检测中国慢性乙型肝炎患者体内是否存在TLMV感染.方法根据日本学者Shunji Mishiro提供的序列选择TLMV-CBD279和CBD231最保守区设计引物,用慢性乙型肝炎且TTV阳性患者血清制备DNA模板,进行PCR扩增;将阳性PCR产物连接至pGEM(r)T质粒,碱裂解法提取质粒DNA并纯化.以T7引物为起始全自动荧光测序仪测序.结果获得了162bp基因序列,该序列与日本株CBD231,CBD279同源性为72%.结论说明在中国慢性乙型肝炎患者体内存在TLMV感染.     

半随机单引物PCR扩增产物的特异性研究

以Ｍ１３ｍｐ１９为模板,寡核苷酸“１２２４”为引物,进行半随机单引物ＰＣＲ扩增;分析其扩增产物的限制性内切酶酶切图谱,推定它们分别在Ｍ１３ｍｐ１９序列中的确切位置;证实引物“１２２４”的３端与模板Ｍ１３ｍｐ１９负链的互补结合,至少需有连续的４上个核苷酸,才能产生单引物ＰＣＲ扩增的模板分子,进行有效的ＰＣＲ扩增,并由此决定了扩增产物中各ＤＮＡ片段的大小及其在模板ＤＮＡ序列中的特定位置。     

巴马香猪CYP3A29 mRNA表达的TaqMan定量方法学建立

目的建立巴马香猪CYP3A29m RNA表达的TaqMan定量方法。方法通过RT—PCR、TA克隆等技术制备CYP3A29-pMDl8-T和β-actin—pMDl8-T实时荧光定量标准品,并以CYP3A29-pMDl8-T标准品为模板,对不同浓度Mg^2＋与探针组合的TaqMan反应体系进行筛选,TaqMan PCR方法,并对其有效性及重复性进行评价。结果筛选到的TaqMan PCR方法为：PCR总体积10μL,其中含l×Buffer、5．5mmol／L Mg^2＋、0．8mmol／L dNTPmix、0．3μmol／L上下游引物、0．2U/μL rTaq、0．1 μnoL／L探针、1μL模板,热循环条件为94℃ 5 min→40cycles（94℃15s→60℃45s→读板）。结论建立了有效测定巴马香猪CYP3A29 mRNA拷贝数浓度的TaqMan PCR方法,通过该方法分别定量CYP3A29和β-actln mRNA的拷贝数浓度,即可求出CYP3A29 mRNA的表达水平。     

PCR反应的动力学模拟和相关因素对扩增结果的影响

PCR技术建立二十年以来,它已经成为生物学实验室不可缺少的一部分。但因为其影响因素多、反应过程比较复杂,到今天为止它还是一个具有某种程度经验性的方法。我们从PCR反应的基本动力学过程分析出发,通过每一轮扩增循环的分析描述了产物的积累过程,在此基础上建立了反应的迭代动力学模型。通过该模型我们模拟了反应使用的模板量、扩增循环数、酶的使用量、酶的半衰期、以及每一轮扩增中变性时间对扩增结果的影响。进一步,我们对模板使用量、扩增循环数、酶的使用量对扩增结果的影响进行了实验验证和探讨;混合模板对扩增结果的影响也同时做了探讨。模拟和实验的结果表明:常规的PCR实验中使用中等偏低的模板量,选择较好的聚合酶同时使用合适的酶量,通过较低循环数的扩增就能得到较为满意的结果。PCR实验的成败最大的限制因素是实验准备过程中引物的设计,而实验过程中的调整优化只能起辅助作用。     

12种作物种子DNA的提取与纯化

采用黄化苗,按氯仿—异戊醇—ＲＮＡ酶法获得ＤＮＡ粗制品,后经酚—氯仿—乙戊醇纯化得１２种作物新品种的ＰＣＲ反应模板ＤＮＡ。结果测量获得的数据和曲线表明：采用本实验的提取方法,可得到具有一定纯度和数量的ＤＮＡ,完全可以满足ＰＣＲ反应所需。     

不同分子量PVP对PCR扩增反应效率的影响

以人为设计的110bp单链DNA为模板,研究不同分子量聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinyl-pyrrolidone,PVP)对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的影响。实验结果表明:0.5%的PVP K-30、PVP 8000、PVP 58000和PVP 630000均可显著提高PCR效率,并且这4种化合物提高PCR效率的能力,依次为PVP 630000>PVP 58000>PVP K-30和PVP 8000;然而,在相同浓度时,PVP K-40却显著抑制PCR扩增反应;另外,溶解曲线的实验结果显示,0.5%PVP 630000可显著降低PCR产物的Tm值,表明PVP 630000可通过与DNA相互作用,降低DNA结构稳定性,使得模板更易在PCR的变性阶段解链,最终提高PCR效率。上述研究结果表明,不同分子量的PVP对PCR扩增效率的影响不同,与其分子量大小密切相关。     

逆转录聚合酶链式反应快速检测水稻条叶枯病毒

逆转录聚合酶链式反应（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＲＴ－ＰＣＲ）具有灵敏度高,准确性好的特点,因而被广泛应用于植物病毒检测。在ＲＴ反应中,ＲＮＡ样品的快速制备尤为重要用异丙醇二步沉淀法获得ＲＮＡ,快速检测水地片中ＲＳｔＶ伯ＲＴ－ＰＣＲ方法,可使测定时间缩短至６ｈ,并可从０．０７８ｍｇ感病叶片中检测出ＲＳｔＶ。     

应用RT-PCR技术检测葡萄扇叶病毒的研究

以扇叶病株为材料，根据病毒外壳蛋白核苷酸序列，设计特异引物P1（1064－1083），P2（762－781），建立了以RNA为模板的GFLV的RT－PCR检测体系。     

B病毒PCR检测方法的建立

目的建立B病毒核酸的PCR检测方法。方法设计引物,用PCR方法扩增B病毒,并验证其灵敏性和特异性。结果引物P1、P2及P3、P4在以B病毒为模板时有特定大小的目的片段出现,在以其他病毒为模板时无目的片段出现;引物P5、P6以B病毒和人单纯疱疹病毒I型(HSVI)为模板能扩增出382bp的产物,经SacⅡ酶切后,B病毒产生176bp和206bp的两个片段,HSVI无变化。结论通过PCR方法成功的区分开B病毒,并且鉴定区分了B病毒和HSVI。     

A new method for preparation of template DNA for PCR from special plant materials

A simple method for preparation of template DNA suitable for PCR amplification from herbarium sampies and plant tissues rich in byproducts, e.g. polysaccharides, tannins, polyphenolic, and terpenoids compounds, is described. The total DNA from regular extraction procedure is absorbed by a small amount of glass powder and the final precipitation of glass powder is used directly as a template for PCR. Taking six plant taxa, including the herbarium specimens of Lythraceae collected from Namibia in 1957 and the silicon-dried leaf tissue from mangrove plants (Rhizophoraceae and Combretaceae) rich in by-products as exampies, the PCR products, including nrDNA ITS regions and cpDNA rbcL gene, amplified following the regular and new methods respectively are compared. Our method provides a simple, rapid and economic approach to purify and prepare template DNA for PCR from special plant materials.``     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.