Unfolding and Inactivation of Green Crab ( Scylla Serrata) Alkaline Phosphatase during Thermal Denaturation *

ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｈａｔｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｃｃｕｒｓｂｅｆｏｒｅｎｏｔｉｃｅａｂｌｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｓｃａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｄｕｒｉｎｇｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅａｎｄｏｔｈｅ...     

Activation of Calf Intestinal Alkaline Phosphatase by Trifluoroethanol

IntroductionAlkaline phosphatase(EC3 .1 .3 .1 ) is a nonspecificphosphomonoesterase that is found in bothprocaryotes and eucaryotes as a dimer withidentical subunits[1] .It belongs to the group ofenzymes attached to the lipid bilayer of membranesby a glycosylphosphatidylinositol anchor[2 4] .Itis ametalloprotein that has two Zn2 +ions and oneMg2 +ion in each active site.Both its catalyticmechanism and structure have been thoroughlystudied and reviewed[5,6 ] .In mammals,alkalinephosphatase is…     

Comparison of Conformational Changes and Inactivation of Penaeus Penicillatus Acid Phosphatase during Unfolding by Urea

ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＡｌｔｈｏｕｇｈｉｔｉｓｇｅｎｅｒａｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｔｈａｔｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｉｎｔｅｇｒｉｔｙｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｅｎｚｙｍｅ，ｒｅｌａｔｉｖｅｌ...     

乙醇对鲍鱼碱性磷酸酶活力与构象的影响

以乙醇为效应物研究对鲍鱼碱性磷酸酶(ALP)活力影响的结果表明．酶的剩余活力随着乙醇浓度增大而迅速下降，乙醇浓度40％可使酶活力完全丧失．说明乙醇对鲍鱼ALP有明显的失活作用，JG50为13％．含较低浓度乙醇(30％)的失活过程是可逆的反应．测定乙醇对酶的失活作用机理．结果表明乙醇对鲍鱼ALP的失活作用是非竞争性机制，说明底物存在不影响乙醇对酶的失活作用．应用荧光光谱、紫外吸收光谱研究鲍鱼ALP经乙醇微扰后的分子构象变化，发现乙醇对酶分子构象有显的影响，酶的内源荧光强度随乙醇浓度增大而增强．荧光发射峰逐渐发生红移．紫外吸收光谱在276nm吸收峰随乙醇浓度增大而增强．这些结果表明．酶蛋白分子中的生色基团残基的微环境发生变化．     

Inactivation and Conformational Changes of Lactate Dehydrogenase M4 during Unfolding in Urea Solutions

ＩｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌＣｈａｎｇｅｓｏｆＬａｃｔａｔｅＤｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＭ４ｄｕｒｉｎｇＵｎｆｏｌｄｉｎｇｉｎＵｒｅａＳｏｌｕｔｉｏｎｓＧｕｏＹｕｙｕａｎ（郭宇远），ＺｈｏｕＨａｉｍｅｎｇ（周海梦）＊Ｄｅｐ...     

杂色鲍碱性磷酸酶在DMSO溶液中的活力与构象变化的研究

以二甲亚砜（DMSO）为效应物．研究其对杂色鲍碱性磷酸酶（ALP）活力的影响，结果表明：该酶的剩余活力随着DMSO浓度增大而迅速下降，当DMSO浓度达40％，酶活力几乎完全丧失．说明DMSO对杂色鲍ALP有明显的失活作用．导致酶活力丧失50％的DMSO浓度为17％．在较低DMSO浓度（〈20％）的失活是可逆的反应过程．动力学研究表明，该酶的失活过程属于混合型．进一步测定游离酶（E）和酶底物络合物（ES）与DMSO的结合常数（K1和K1s），结果表明K1〈K1s即说明底物存在对酶被DMSO的失活作用有一定的保护作用．应用荧光发射光谱研究杂色鲍ALP经DMSO微扰后的分子构象变化情况，随着DMSO浓度增大，荧光强度逐渐增强．但发射峰未发生明显变化现象．说明酶分子中的生色基团残基的微环境发生了一定的变化．     

耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据耐热碱磷酸酯酶基因的酶切图谱和ＤＮＡ序列,分别在基因的起始密友子和终止密码子设计２个突变引物。引物的５‘端分别带有ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切全点。通过ＰＣＲ从质粒ｐＴＡＰ１１８Ｂ中扩增获得了ＦＤ－ＴＡＰ基因的全序列。经过酶切将基因亚克隆于高达载体ｐＪＬＡ５０３。     

凡纳对虾体内ACP、AKP酶的细胞化学定位

运用电镜酶细胞化学技术对凡纳对虾体内肝脏(L)、肌肉(M)、心脏(H)和复眼(E)等四种组织的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)进行了细胞化学定位,并与感染病毒的凡纳对虾四种组织中ACP、AKP的细胞化学定位进行比较.结果显示,在健康的对虾体内,ACP依次出现在各组织中的溶酶体、细胞核、细胞内膜、线粒体、内质网以及肝脏组织中的部分脂滴周围及微绒毛中AKP依次出现在各组织中的细胞膜、细胞核、溶酶体、内质网以及肝脏组织中的脂滴周围及微绒毛中.感染病毒后,对虾体内组织细胞出现了明显的病理变化,各组织细胞内均出现大量的髓样小体;各组织中ACP,AKP的超微细胞化学定位也发生了明显的规律性变化,表现为相应细胞器内ACP,AKP酶活性均减弱或消失,并在多数组织的细胞质中检测到ACP,AKP酶活性的高电子密度颗粒,且大量出现的髓样小体均呈阳性反应.     

长期饥饿和再投喂对泥鳅不同组织糖原、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的影响

研究长期饥饿和再投喂对泥鳅肝、消化道和肌肉3种组织细胞糖原、酸性和碱性磷酸酶的细胞化学变化.对泥鳅进行饥饿处理,0～28 d不喂养食物,29～35 d恢复正常喂食.分别于0,7,14,21,28和35 d取材,利用显微石蜡切片、组织化学染色的方法检测其肝、消化道和肌肉细胞糖原、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)细胞化学特征.结果表明,随着饥饿程度的加深,糖原的量减少,碱性磷酸酶活性下降,酸性磷酸酶活性则增强,投喂后,糖原量、酸性和碱性磷酸酶活性都有不同程度的恢复.整个过程中,它们的变化存在组织差异.泥鳅中酸性和碱性磷酸酶均与长期饥饿条件下机体的应激反应有关.     

氨基酸对鲍鱼碱性磷酸酶活力的影响

选用L Ala、L Val、L Leu等15种氨基酸为效应物,研究它们对杂色鲍(Haliotisdiversicolor)碱性磷酸酶(EC.3.1.3.1)催化pNPP水解反应的影响.结果表明:上述这些氨基酸对鲍鱼碱性磷酸酶均有一定程度的抑制作用,抑制程度随着试剂浓度增大而加剧.当浓度为10.0mmol/L时,分别可以使酶活力下降:7.77%、36.75%、22.79%、39.86%、16.16%、19.33%、94.77%、20.19%、17.02%、40.15%、31.08%、17.52%、30.56%、36.77%和12.59%.尤其以L Cys对酶的抑制作用最为显著(抑制率为94.77%),其次是L Ile和L His,它们均能使酶活力下降40%;对酶抑制率在30%以上的氨基酸还有L Val、L Trp、L Phe和L Lys,其它选用的氨基酸对酶的抑制率小于25%.选择对杂色鲍ALP具有较明显的抑制作用的氨基酸L Val、L Ile、L Trp和L Cys等氨基酸为研究对象,研究它们对酶催化pNPP水解反应的抑制作用机理,并测定其抑制常数.结果表明L Cys的抑制作用为混合型效应,其KI和KIS值分别为0.042mmol/L和0.139mmol/L;而L Val、L Ile、L Trp为反竞争性,其KIS分别为9.56、8.55、8.09mmol/L.     

Direct Promotion of Collagen Calcification by Alkaline Phosphatase

IntroductionAlkalinephosphatase(AP)hasbeenthoughttobeimportantintheprocessofbiocalcification[1].APwasthefirstenzymeassociatedwithcalcificationactivityintissuesandremainsasthebestcharacterizedenzymeinthecalcificationprocess.Yet,importantquestionsabouttheroleofthisproteininbiocalcificationremainunanswered,anditcontinuestodrawfocusedattentionincalcifiedtissueinvestigations[2].APpromoteshydrolysisofphosphatecontainingsubstrates[1],producesorthophosphateandcausesariseininorganicphosphateandtherem…     

赤子爱胜蚓碱性磷酸酶的酶学性质研究

以赤子爱胜蚓(Eisenia foetida sarigng)整体为材料，采用正丁醇抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素柱层析、葡聚糖凝胶过滤等方法分离纯化得到蚓体中的一种碱性磷酸酶(AKP)并对其性质进行研究。经测定其分子量为126000Da，富含谷氨酸、脯氨酸。以磷酸苯二钠为底物，测其最适温度为37℃，最适pH为10．10，Km值为1．15mmol／L，Mg^2 、Ca^2 、Mn^2 对酶有激活作用，KH2PO4、ME、EDTA、L-Cys、DFP则对AKP有抑制作用。     

家蚕碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质

经10％～50％硫酸铵分级沉淀分离，DEAE—Sepharose离子交换柱层析,Sephacryl S-200凝胶过滤纯化,从家蚕（Bombyx mori）肠液中分离纯化出电泳纯的碱性磷酸酶、该酶提纯倍数为464倍，比活力为3936U／mg、酶学性质和动力学性质研究表明，该酶催化磷酸苯二钠的水解反应，最适pH值为10.5，pH小于7.5和大于11均不稳定；最适温度为40℃，温度高于50℃不稳定；米氏常数Km值为1．25mmo1／L.     

鲍鱼碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究

以杂色鲍(Haliotis diversicolor)内脏为原料,经Tris HCl缓冲液(pH 7.5,含0.1mol/L NaCl)抽提,正丁醇处理,硫酸铵分级沉淀分离,DE 32离子交换、Sephadex G 150分子筛、DE 32纯化,得到电泳单一纯的碱性磷酸酶制剂,比活力为1 226 U/mg.酶学性质和动力学性质研究表明:该酶催化对硝基苯磷酸水解反应的最适 pH值为 10.08,最适温度为48℃.米氏常数Km 值为0.80 mmol/L,Vm 值为20.1 mmol/L·min-1(pH 10.0,37℃).酶的热稳定性研究表明:该酶在pH 7~11区间和在温度低于55℃下稳定.金属离子对酶活力的影响结果表明:Li+、Na+和K+对酶活力没有影响,Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+和Co2+对酶有不同程度的激活作用,而Cu2+、Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ag+、Bi2+和Pb2+等对酶起抑制作用.     

耐热碱性磷酸酯酶(TAPND27)的表达、纯化和性质测定

通过分离纯化和酶学性质测定,确定耐热碱性磷酸酯酶（ＴＡＰＮＤ２７）为八聚体,最适反应温度为６５℃,在９９℃保温３０ｍｉｎ仍保留４９．４％的活性,在质量分数为５％的Ｔｗｅｅｎ２０体系中依然有７０％以上的酶活性,并且有很宽的ｐＨ稳定范围。这表明ＴＡＰＮＤ２７适合在高温条件和高浓度去污剂的体系中应用。     

金属离子对鲍鱼碱性磷酸酶活力的影响

碱性磷酸酶(ALP,EC3.1.3.1)是一种金属酶,其结构的维持和酶活性的表现均需金属离子.本文研究了几种金属离子分别对鲍鱼ALP活力的影响.结果表明,Li ,Na 和K 等正一价碱金属离子对酶活力没有任何效应;碱土金属离子Mg2 ,Ca2 和Ba2 对酶有激活作用,其激活程度依次为:Mg2 >Ca2 >Ba2 ,而且Mg2 在5.0mmol/L时可以使酶活力提高267%;在过渡金属离子中,Zn2 ,Mn2 ,Co2 和Cu2 对酶的效应不同,Zn2 、Cu2 为抑制作用,而Co2 、Mn2 表现为激活作用;重金属离子Hg2 、Pb2 、Ag 和Cd2 对酶有抑制作用,其中Hg2 的抑制效应最强,1.0mmol/LHg2 可使酶活力抑制94%.研究Mn2 和Cu2 的抑制类型表明,Mn2 为混合型激活作用,而Cu2 对酶的抑制类型为非竞争性抑制作用,其抑制常数(KI)为0.316mmol/L.     

正畸牙移动过程中龈沟液碱性磷酸酶活性的变化

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）被认为是成骨细胞分化和功能状态的重要标志，为评价正畸牙移动过程中ALP活性的变化趋势及其所起的作用，选择17颗需远中移动的正畸尖牙，分别在加力前与加力后1h、24h、7d、14d、21d和30d收集尖牙近远中侧龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF），生化分析ALP活性的变化．结果显示：加力后7d、14d和21d，GCF-ALP活性均较受力前显著增加（p〈0．05），且在14d达到峰值（p〈0．01）；近、远中位点GCF-ALP活性存在差异，近中侧大于远中侧（p〈0．05）．表明GCF-ALP活性的变化趋势反应了正畸力作用下牙周骨组织改建模式，并与牙移动过程密切相关．ALP是反应正畸牙移动和牙周组织改建生物指标之一．     

家蚕碱性磷酸酶的功能基团研究

用PCMB、NBS、PMSF、TNBS、SUAN、DTT、BrAc、IAc等在一定条件下选择性修饰家蚕碱性磷酸酶的部分氨基酸残基,对酶活力的变化进行测定.结果表明:PMSF、SUAN、BrAc、IAc和TNBS的修饰能显著抑制酶的活性,且酶活力降低程度与修饰剂的浓度相关;PMSF、DTT和NBT的修饰对酶的影响较小.初步认为,巯基和组氨酸的咪唑基可能是家蚕碱性磷酸酶的必需功能基团,赖氨酸残基和二硫键对保护酶的催化能力是必需的.     

耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的三维结构分析

有计算机图像模拟,能量极小化和分子动力学方法,以大肠杆菌碱性到酯酶（ＢＡＰ）为主要结构模板,构建了耐热碱性到酯酶（ＦＤ－ＴＡＰ）的三维结构,并分析了它的结构特征,从而为酶蛋白的结构、催化反应活性和热稳定性间关系的进一步研究打下了很好的基础。