我国2020年下半年SARS-CoV-2病毒株的基因突变分析

基于2020年6月1日—12月1日GISAID网站(http:∥platform.gisaid.org)公布的来自中国(不含台湾地区)的全部21条病毒基因组序列,以2019年12月公布的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)参考株NC_045512和MN996528进行各基因组错义突变位点分析,计算突变频率,寻找各突变最早出现的时间和地点,GISAID网站内搜索相似病毒株.结果显示:我国2020年下半年公布的北京市、浙江省、辽宁省大连市、云南省、山东省青岛市五地全部21个病毒株中共有18处错义突变,集中分布于Spike(S)、ORF1ab和Nucleocapsid(N)基因.S蛋白的D614G突变和NSP12(RdRp)蛋白的P323L突变具有最高的突变频率;除北京市的病毒株中发现的一个新突变位点外,其他位点突变均主要出现于欧洲或北美洲.根据突变位点分类,病毒株均属于欧洲的G支系,其中云南省的病毒株属于GH支系,与来自于泰国等亚洲的病毒株相似;山东省青岛市、辽宁省大连市、浙江省、北京市的病毒株属于GR支系,与来自欧洲的病毒株相似.综上,2020年下半年我国SARS-CoV-2病毒株主要为外源输入病毒株,在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)防控策略上要在各运输环节严防外源输入;病毒新突变在严格的防控措施下未发生扩散,进一步说明我国采取的防控措施非常有效.     

基于位点特异性打分矩阵的卷积神经网络预测SARS-CoV-2核衣壳蛋白的蛋白质二级结构

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)有4种关键的结构蛋白,而核衣壳蛋白就是其中的1种.本实验从公开数据库NCBI上选取的SARS-CoV-2核衣壳蛋白质序列数据,分析SARS-CoV-2核衣壳蛋白与SARS-CoV核衣壳蛋白的序列相似性,对SARS-CoV-2核衣壳蛋白的理化性质和疏水性进行分析;在此基础上提出基于位点...     

基于深度学习的SARS-CoV-2 RBD-ACE2结合亲和力预测方法

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的快速变异导致不断出现新的毒株.已有研究表明SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域(Receptor Binding Domain,RBD)与宿主ACE2的结合亲和力与病毒的侵染能力相关.随着新型冠状病毒在全球的持续暴发，出现了大量RBD多点突变的新毒株.通过生物试验方式获得突变毒株RBDACE2结合亲和力费时费力，远远落后于突变株的积累，不能满足对该病毒实时监控的需求.为了快速预测具有多点突变毒株的结合亲和力，设计了一种深度神经网络模型.该模型结合卷积神经网络、循环神经网络与注意力机制，从RBD序列上学习关键特征并预测RBD-ACE2的结合亲和力,在真实数据集上对模型进行训练和评估.实验结果表明新模型可以有效地预测关切变异株的RBD-ACE2结合亲和力，也有助于对SARSCoV-2突变株的传播能力进行监控.     

雪豹源水貂肠炎病毒分子鉴定及NS1基因进化分析

本研究对青海省西宁市野生动物园雪豹发生的疑似水貂肠炎病毒(MEV)腹泻粪便样本利用分子生物学方法进行了鉴定.结果显示:共成功鉴定到两株MEV(QH1/2),并对MEV的NS1基因进行了克隆测序分析,两株病毒株间核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.65％和99.55％;MEV-QH1/2病毒株与其他株间NS1氨基酸比...     

猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1a株结构蛋白基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法克隆了我国首次分离的PRRS病毒CH-1a株的6种结构蛋白基因(ORF2～7),并进行了核苷酸序列测定．利用序列分析软件分析了各基因编码产物的分子量、等电点、疏水性、抗原性和糖基化位点等,并与欧美毒株进行了比较,绘制了其系统发育进化树．结果显示cH-1a株与流行于北美洲的PRRS病毒株遗传关系很近,而与欧洲的病毒株遗传关系较远,表明流行于我国的PRRS病毒可能来自北美洲。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的扩增与序列分析

为了解凉山地区传染性法氏囊病病毒(IBDV)的分子特征,利用实验室采集保存的感染IBD的法氏囊提取出总RNA.采用RT-PCR方法对IBDV VP2基因进行扩增,测序后与GenBank中的参考序列进行比对分析.结果表明,试验成功扩增出1 369 bp的VP2基因片段;样品与弱毒株和经典毒株的核苷酸同源性高达98.4%～99.6%;系统发生树表明样品中的IBDV与弱毒株B87亲缘关系最近;样品与弱毒株的氨基酸序列同源性为98.9%～99.1%;样品中的IBDV分子特征完全符合弱毒类型的特征,样品与弱毒株的抗原性基本一致,推测样品中的IBDV应与弱毒株或疫苗毒株同一来源.该毒株与疫苗用毒株亲缘关系最近,且IBDV疫苗多为活疫苗,因此,试验结果说明凉山地区IBDV免疫接种率可能较高,但应该拟定更合理的免疫程序.     

AcMNPV大立方形多角体突变株突变位点的证实

纯化了３株在共转染后形成正常多角体的病毒株,提取其病毒ＤＮＡ,并对其做了ＥｃｏＲⅠ、ＢｇｌⅡ酶切分析;克隆含多角体蛋白基因的ＥｃｏＲⅠＩ片段并进行序列测定,证实了此病毒株为回复突变株．     

新型冠状病毒感染实验动物的风险评估

摘要:目的 2019 年 12 月暴发的新型冠状病毒( SARS-CoV-2) 迅速传播,严重影响了社会生活正常运行。 由于新型冠状病毒受体血管紧张素转化酶( ACE2)在人及动物中的保守性,有必要对常见家畜及实验动物的易感性进行评估。 方法 基于 ACE2 的氨基酸序列,分析其在人、实验动物及家畜等动物中进化关系;根据冠状病毒受体结合结构域( Receptor binding domain,RBD)与 ACE2 的结合位点,比较其在物种间的变化,推测不同物种对新型冠状病毒的易感性。 结果 新型冠状病毒与 ACE2 的结合位点在不同物种间较为保守,且 ACE2 受体与新型冠状病毒RBD 的结合位点在人、猴和仓鼠的完全一致。 结论 基于位点比较和 SARS-CoV-2 感染动物特性分析,猴和仓鼠可能对新型冠状病毒较为易感,可以优先选择它们作为 SARS-CoV-2 感染动物模型。     

尿激酶体外抑制人体免疫缺损病毒的侵染能力

人体免疫缺损病毒的包膜蛋白gp120的V3环区包含一段在人类蛋白质中很少出现的高度保守序列，但这段序列与纤溶酶原被纤溶酶原激活剂酶切位点附近序列有同源性．由于V3环区在人体免疫缺损病毒侵染细胞过程中的重要性，评估了尿激酶对人体免疫缺损病毒侵染能力的影响．通过检测逆转录酶活力，P24抗原的表达和合胞体形成情况发现尿激酶可以抑制人体免疫缺损病毒对多种淋巴瘤和白血病细胞系，如MT4、CCM、H9和外周血单核细胞的侵染能力，并且这种抑制与尿激酶浓度呈剂量依赖关系．那些能够被尿激酶抑制的人体免疫缺损病毒株其V3环区序列必须与纤溶酶原激活区亭列同源，实验事常用病毒株包括BRU和RF以及某些野生病毒株．研究结果显示尿激酶在体外实验中可以抑制人体免疫缺损病毒的侵染能力．     

人巨细胞病毒临床低传代病毒株UL97 基因的克隆与分析

分离人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代GZ02病毒株,并根据GenBank提供的实验室标准病毒株HCMV AD169磷酸转移酶基因UL97 DNA序列及有关文献设计引物,从HCMV GZ02病毒株基因组DNA中通过PCR扩增UL97基因,并克隆至pGEM3Z质粒载体．重组质粒经测序鉴定,发现HCM VGZ02病毒株UL97基因序列保守区域与HCMV AD169 UL97长度完全一致,但发生G205A、G761A、T823C、T1173C、T1282C、T1334C、T2106C等7个位点的碱基突变,涉及到编码氨基酸E69K,S275P,C428R和F445S位点发生改变。     

新疆猪瘟病毒分子流行病的研究

采用RT-PCR方法从新疆临床发病猪场采集的病料中扩增了CSFV流行株E2基因的主要抗原位点编码区，测定了15株CSFV的核苷酸序列。应用DNAstar计算机软件对6个地区6个代表株CSFV的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析，结果表明：新疆6株CSFV流行株与猪瘟兔化弱毒株(C株)核苷酸序列的同源性为80．9％～82．8％，氨基酸的同源性为86．2％～88．3％，说明新疆CSFV流行株E2基因发生了部分变异，与疫苗株相比抗原性产生一定的差异。     

恒河猴类麻疹综合症的病原检测

对暴发类麻疹综合症的恒河猴病料组织进行了电镜观察,发现有副粘病毒粒子,然后分别合成了麻疹病毒及犬瘟热病毒的特异性引物,对病料进行RT-PCR扩增,从发病死亡的恒河猴脏器中扩增到犬瘟热病毒核蛋白基因287bp的特异片断,而麻疹病毒的检测为阴性.扩增到的犬瘟热病毒核酸片段经序列测定并与GenBank中的犬瘟热病毒毒株进行了比较,发现死亡恒河猴脏器中扩增到的片段序列与犬瘟热病毒疫苗株Onderstepoort、标准野毒株A75-17基因序列的同源性较高,研究结果表明引起恒河猴发病的病原体为麻疹病毒属的犬瘟热病毒.     

猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）已发表的核苷酸序列,设计了1对特异性引物P1／P2,用RT-PCR扩增了PRRSV福建毒株FJ-1和FJ-2的全长核衣壳蛋白基因（ORF7）,将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,提取阳性重组质粒进行序列测定与分析．结果表明：FJ-1和FJ-2毒株ORF7基因均为372bp,编码123个氨基酸,与美洲型参考毒株VR-2332及欧洲型参考毒株LV的核苷酸同源性分别为95．16％,94．35％和61．40％,60．65％,其推导的氨基酸同源性分别为95．93％,95．12％和56．49％,55．73％．研究表明,福建流行的FJ-1和FJ-2属于美洲型PRRSV毒株．     

SARS-CoV-2和新型冠状病毒肺炎:发病机制与药物开发研究进展

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是一种新发现的传染性人类冠状病毒,可导致新型冠状病毒肺炎(COVID-19).阐述了SARS-CoV-2的病原性特征,及其导致的新型冠状病毒肺炎的临床症状、致病机理与免疫反应特点;概述了当前针对COVID-19的治疗方案和潜在新疗法,及针对SARS-CoV-2的疫苗开发进展,以期加深人们对SARS-CoV-2和COVID-19的了解,帮助人们制定策略遏制COVID-19大流行.     

空气中SARS-CoV-2病毒富集方法的建立及应用（英文）

冠状病毒可以通过许多不同的方式传染,气溶胶是SARS-CoV-2的传播方式之一.为了避免交叉感染,有必要对定点医院不同大气环境中新型冠状病毒含量进行监测.分析了SARS-CoV-2疫情期间在兰州定点医院的公共区域(低风险区域)、隔离病房缓冲间(中风险区域)和隔离病房(高风险区域)收集的21份气溶胶样本.气溶胶样本检测结果均为阴性,表明定点医院不同区域的严格消毒措施能有效消杀SARS-CoV-2病毒,降低定点医院空气传播病毒的风险.     

蜜蜂囊状幼虫病毒多聚蛋白基因遗传结构分析

为了解蜜蜂囊状幼虫病毒的遗传变异及分化,采用多聚蛋白基因对其进行遗传结构分析.结果表明:在比对的441bp基因片段中,有356个保守位点,85个变异位点,无缺失位点.构建系统进化树显示该病毒存在3个明显的分支,分支Ⅰ为中国的重庆、云南病毒株;分支Ⅱ为印度病毒株;分支Ⅲ为德国、英国、奥地利、韩国病毒株.中国、韩国、尼泊尔、印度等亚洲地区存在多个病毒株.中介网络图显示病毒株基本按照宿主种类进行聚类,表明同一地区存在多个病毒株系可能与宿主有密切关系.     

一株野生鹧鸪源冠状病毒主要结构基因进化特性分析

从野生禽类鹧鸪的喉气管拭子中分离到1株冠状病毒，命名为Partridge/GD/S14/2003（简写为S14）.通过RT-PCR扩增、克隆测序获得了该毒株的全基因组序列（AY646283），序列经DNAstar分析发现，S14毒株与肾型毒株JX1-99，TJ2-96 S1基因同源性最高，分别达到94.6%和93.4%，并且该毒株的S1基因还和QXIBV，LX4株也存在高度亲缘性，分别达到85%和84.3%，同时对S14 S1基因BLAST时发现只有上述毒株和S14有高度同源.由此推测该鹧鸪分离株S14的进化可能与IBV肾型和腺胃型病毒存在一定关系.序列分析表明，S14毒株与GenBank中注册序列QXIBV，LX4的S2基因同源性最高分别达到97.2%和90.6%，都处于Ⅱ群.M基因系统进化树研究发现，S14处于Ⅲ群，与SAIB20，GD698同源性最高，分别达到90.6%和90.2%；而与其S1，S2基因同源较高的BJ，QXIBV株，M基因的进化关系却较远.N基因同源性和系统进化树分析发现，Ⅰ群毒株可能为H52和Gray株发生重组的结果，Ⅱ群毒株可能为H120和D1466等毒株重组的结果，而S14株处于Ⅲ群，其N基因与QXIBV高度同源，达到95.7%，Ⅳ群为肾型分离株.而与其M基因亲缘性最近的SAIB20，GD698则分处Ⅰ，Ⅳ进化群.     

传染性法氏囊病快速诊断技术的建立及其应用

根据已发表的IBDV各致病型毒株的序列，在病毒结构蛋白VP2编码基因的高变区(VP2 variable domain,vVP2)两端外侧的保守序列内设计合成了2条寡核苷酸引物，对各种不同致病型的12株参考毒株进行逆转录酶一聚合酶链式反应(RT—PCR)的检测．结果 12个参考毒株均能扩增出约679 bp的目的片段，而对作为阴性对照的常见5种鸡病病原NDV、IBV、CAIV、E．coli、pM均没有扩增出任何片段；应用建立的技术对疑似IBD的34份临床病料进行检测，并同时在基础RT—PCR扩增的片段内设计另一对引物进行Nested—PCR检测．结果基础RT—PCR方法检测到ll份阳性，Nested-PCR检测到23份阳性．研究的结果表明建立的IBD的RT—PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点．在此基础上设计的Nested—PCR则大大提高了阳性检出率(提高52．1％)．     

昆明地区1株HAM野毒株的基因分型

免疫捕获粪便悬液中的HAV，RT－PCR扩增目的的片段，将其连接到载体pUC18中，测序并对序列进行分析和比较，HAV野毒株W在核苷酸3024－3191与HM175/wt序列相同，表明W株为ⅠB亚型；该株5'NTR的核苷酸29－258与其它国际毒株有很大的不同，有碱基的、缺失和插入，其中插入的15个碱基是其它毒株所没有的。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.