斜带石斑鱼白细胞介素8基因的克隆与表达分析

为了研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)白细胞介素8(IL-8)的结构和功能,本实验对其基因序列进行了克隆和分析. 运用RACE-PCR方法,从斜带石斑鱼总RNA反转录cDNA库中获得了961 bp 长的cDNA全序列. 同时利用RT-PCR 技术,检测了微壁溶球菌诱导前后该基因在斜带石斑鱼体内不同组织之间的表达差异. 结果表明,斜带石斑鱼IL-8cDNA序列包含235 bp 的5′非编码区,438 bp的3′端非编码区和288 bp 的开放阅读框,编码95个氨基酸. 未诱导前,斜带石斑鱼IL-8基因主要在心、头肾、脾和肝脏中表达,在鳃和肠中量表达,在胃、肌和皮中几乎没有表达;诱导后,IL-8基因强烈表达于所有取样器官. 所获得的斜带石斑鱼IL-8基因是一种与炎症作用有关的CXC亚族趋化性因子.     

斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化

将含有斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus,OGNNV)主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因的重组表达质粒载体pET32a-MCP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,证实了重组大肠杆菌融合表达了斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白.表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,提取的包涵体中融合蛋白含量占60%以上,经柱层析纯化蛋白,纯化度达90%以上.     

斜带石斑鱼ERP44基因的克隆与表达分析

为进一步了解内质网蛋白44基因(ERP44)在石斑鱼免疫反应中的作用,本研究根据实验室石斑鱼转录组数据中ERP44的表达序列标签(EST)设计引物,克隆了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)Ec-ERP44基因的开放阅读框序列(ORF),利用生物信息学手段分析Ec-ERP44基因及其编码蛋白的序列结构和特征,并通过实时荧光定量PCR检测该基因的组织分布特征,以及脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid, Poly I:C)刺激后该基因在石斑鱼脾脏中的表达变化。研究结果表明,Ec-ERP44基因ORF全长1 233 bp,编码410个氨基酸;该蛋白具有蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族保守的硫氧还蛋白结构域。同时,Ec-ERP44基因在健康石斑鱼体内的多种组织均有表达,其中在脑组织中的表达量最高;在LPS与Poly I:C刺激后,石斑鱼脾脏中Ec-ERP44基因的表达显著上调。本研究结果表明,Ec-ERP44基因参与了石斑鱼抗病原感染的免疫反应。     

斜带石斑鱼神经坏死病毒基因组RNA1和RNA2序列测定及分析

根据GenBank数据库公布的鱼类神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)同源序列设计了7对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出目的片断,将PCR产物测序和分析.斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒(orange-spotted NNV,OGNNV)基因组由两个片断(RNA1和RNA2)组成,RNA1由3 103个核苷酸组成,含有一个开放阅读框,编码982个氨基酸;RNA2由1 433个核苷酸组成,含有一个开放阅读框,编码338个氨基酸.OGNNV基因组与新加坡GGNNV(greasy grouper NNV)的基因组有高度的相似性.分析病毒的RNA2序列发现:OGNNV与DGNNV(dragon grouper NNV)、RGNNV(redspotted NNV)和GGNNV的亲缘关系很近,并且具有相同的中和位点;分析病毒的RNA1序列,发现在OGNNV的RNA1序列中同样可以找到依赖RNA的RNA聚合酶的6个模序(motif).根据同源性比较和系统进化分析,OGNNV属于RGNNV血清型的成员.     

维生素E和维生素C对斜带石斑鱼亲鱼产卵质量的影响

在饲喂斜带石斑鱼Epinephelus coioides亲鱼的新鲜鲜杂鱼中添加w=0.2%的维生素E或w=0.5%维生素C,经过45 d的营养强化之后,在4-6月期间采集受精卵,孵化成仔鱼,并测定其营养成分.结果显示,亲鱼饵料中添加维生素E不仅可以增大亲鱼受精卵的卵径、油球直径和仔鱼全长,而且影响受精卵脂肪酸的组成,受精卵中n-3 PUFA和n-6 PUFA的含量以及PUFA/SFA、DHA/EPA的比值显著高于对照组;亲鱼饵料中添加维生素C对卵径、油球直径、仔鱼全长和受精卯脂肪酸的组成没有明显影响.由此表明,斜带石斑鱼亲鱼饲料中添加维生素E可以改善受精卵的质量和仔鱼质量,而添加维生素C对受精卵卵径、受精卵脂肪酸组成和仔鱼全长没有显著影响.     

斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE方法获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein,TBT-bp)肝脏基因的cDNA全长序列.TBT-bp基因cDNA序列全长836 bp,含696 bp的开放阅读框,编码231个氨基酸.虽然编码蛋白序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和底鳉(Fundulus heteroclitus)TBT-bp2序列同源性不高(分别为52%、20%),但是保守的信号肽序列结构与二级结构分析提示它们属于同一蛋白家族.系统树分析表明,此次克隆得到的斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因cDNA序列属于2型三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein type2,TBT-bp2).斜带石斑鱼TBT-bp基因cDNA全序列的获得为海水养殖鱼类中三丁基锡的去毒代谢相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗及仔鱼成活率有重要意义.     

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列.同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895).RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势.推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用.     

斜带石斑鱼TLR5S基因结构及功能分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)属于先天免疫系统中的一种模式识别受体(PRR),可分为可溶型和跨膜型2种.它可以识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),从而启动信号转导.本研究从NCBI数据库中得到斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)可溶型TLR5(ECTLR5S)cDNA全长序列(Genbank登录号:GQ396667).其cDNA序列全长2 439bp,包括69bp的5′UTR,435bp的3′UTR和1 935bp的开放阅读框,共编码644个氨基酸,预测编码蛋白质分子质量为72.28ku,等电点为6.37.将ECTLR5S基因氨基酸序列与其他脊椎动物的TLR5S基因氨基酸序列进行比对,结果显示出很高的相似性,其中与牙鲆相似度可达69%.Real time PCR检测结果显示ECTLR5S基因在斜带石斑鱼不同器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,其次是脾脏、血淋巴、肾脏等.Realtime PCR检测ECTLR5S基因在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染3,6,12,24,48h后的肝脏中表达情况,结果显示ECTLR5S基因在3,6,12,24h时表达量显著上调(p<0.05),而在48h下降至初始水平.这些结果说明ECTLR5S基因可能参与到斜带石斑鱼抗弧菌感染的免疫反应中,并且肝脏是其发挥作用的重要器官.     

赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析

基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.     

斜带石斑鱼受精卵及仔稚鱼生理生态学的研究进展

综述了近年来国内外在斜带石斑鱼受精卵及仔稚鱼的发育、仔稚鱼对理化环境的耐受性及摄饵机制等方面的研究进展,并对今后斜带石斑鱼的发展前景提出了几点建议．     

麻疯树基因JcKNOX1的克隆和表达调控分析

KNOX同源异型盒基因在植物生长发育中扮演着极其重要的角色,首次从大戟科植物麻疯树cDNA中克隆到一个同源异型盒基因,命名为JcKNOX1.其开放阅读框全长693bp,编码230个氨基酸残基,预测蛋白质等电点pI=6.13,分子量PA=25.92kD.聚类分析表明,JcKNOX1与毛白杨在进化上具有最近的亲缘关系,其次是甜橙.荧光定量PCR检测发现,JcKNOX1基因在麻疯树植株各个器官中均有表达,幼嫩部位表达量明显高于成熟器官,表达量依次为:茎尖嫩叶茎叶花叶柄根;对麻疯树幼苗进行ABA和低温胁迫发现,JcKNOX基因表达量明显增加.上游调控元件预测分析表明,该基因可能在麻疯树光调节、激素调控、花粉基因特异性表达、逆境调控等重要生物学过程中具有重要作用.     

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

 通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列。同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895)。RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势。推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用。     

益肾活血平喘合剂对哮喘大鼠气道TGF β1表达的影响

目的:探讨益肾活血平喘合剂对哮喘大鼠气道TGF β1表达的影响。方法:健康雌性SD大鼠60只。随机分为4组,即正常组、模型组、地塞米松阳性对照组、益肾活血平喘合剂组,每组15只大鼠。除正常组外,其余3组均利用哮喘模型。各组于造模后14 d开始每天给药及雾化吸入。造模后28 d处死动物,取同一部位肺叶,包埋,切片,HE染色及免疫组化检测气道TGF β1的表达。结果:益肾活血平喘合剂组气道TGF β1的表达明显少于模型组(P<0.01)及阳性对照组(P<0.05)。结论:益肾活血平喘合剂通过抑制气道TGF β1的表达,减轻哮喘气道炎症及重塑的发生。     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

斜带石斑β-珠蛋白cDNA的克隆和序列分析

从斜带石斑EpinephelusCoioides白细胞cDNA库随机挑取噬菌斑，做为模板，用λTriplEx5'3'长距离插入子筛选引物，进行插入片断的PCR扩增，并进行表达序列探针（ESTs)测定。从中克隆到了血红蛋白β亚基cDNA,cDNA包含长达444bp的开放阅读框，编码147个氨基酸的多肽。用www.expasy.ch网站的compute pI/MW程序计算其可能的相对分子质量为16544，等电点为6.95。其氨基酸序列与草鱼β-珠蛋白Ⅲ的同源性最高，为73.0%。在远端和近端的与血红素结合的组氨酸都是保守的，另外，与其它鱼类及蛙，鸡和人的β-珠蛋白比较，在血红素结合区及亚基结合区的氨基酸残基均是高度保守的。     

大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.     

斜带石斑鱼Frizzled 4基因的克隆及表达分析

利用同源克隆和RACE的方法,从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)卵巢中克隆了Frizzled4(g FZD4)的全长c DNA序列.g FZD4的c DNA序列全长2 033bp,其中开放阅读框1 596bp、编码531个氨基酸.氨基酸序列比对和系统树分析显示,g FZD4的结构十分保守,斜带石斑鱼与鲈形目罗非鱼的亲缘关系最近.RT-PCR分析表明,g FZD4基因在斜带石斑鱼组织中广泛表达,其中脑、肾脏、心脏和腮组织的表达量较高.荧光定量PCR检测结果显示,g FZD4基因的表达水平在胚胎发育的早期较低、在桑葚期显著升高、在囊胚期最高,其后除了肌节形成期外均基本与桑葚期的表达水平相似;g FZD4基因在卵巢发育过程中表达水平较低,而在性逆转的精巢发育过程中表达水平显著升高,表明g FZD4介导的Wnt信号通路在石斑鱼的性逆转过程中可能发挥了重要作用.     

佛手GRAS基因的克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从芸香科柑橘属不耐寒植物佛手中分离得到了一个表达序列标签(EST)片段,结合RACE技术克隆获得该基因的1 669 bp序列,编码区长1 236 bp,编码413个氨基酸.通过Blastn同源序列比对分析,结果显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高;与GenBank数据库比对分析,表明该基因具有GRAS特有的保守结构域.因此,命名该基因为:CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647).用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法研究了该基因在低温胁迫处理下的表达特性,结果显示该基因在低温胁迫后的表达量有明显的变化.     

鳜IL-1β基因的克隆及原核表达

用RACE PCR获得了鳜白介素-1β(IL-1β)的全长cDNA.鳜IL-1β的cDNA全长为1298 nt(核苷酸),其5′非编码区包含UTR 93 nt;3′非编码区包含452 nt;其开放阅读框内包含753 nt,翻译成251个氨基酸.将鳜IL-1β克隆到原核表达载体pET-32a上,在大肠杆菌Rosettagami(DE3)内以包涵体形式得以高效表达.     

枣中APETALA1（AP1）同源基因的克隆及其表达特征分析

通过观察枣结果枝的形态学特征,我们发现生长早期结果枝(长度小于20 mm)和结果枝先端的花芽分化并未完成.在形态学观察的基础上,通过反转录PCR和快速扩增cDNA末端的方法从枣树中克隆得SQUAMOSA/APETALA1同源基因,定名为ZjAP1(GenBank登录号:EU916199).ZjAP1开放阅读框长738 bp,3'-和5'-非编码区均显示出长度多态性.ZjAP1编码的氨基酸序列含245个氨基酸,含有SQUA/AP1类MADS盒蛋白典型的保守结构域,且ZjAP1与蔷薇科植物中的同源蛋白同源性最高.ZjAP1表达分析表明ZjAP1在生长日期结果枝、结果枝先端、根、茎、叶、腋芽、花苗、花和幼芽均有表达,揭示着ZjAP1同时参与了枣树的营养生长与生殖生长.