有效微注射和移植受精卵建立转基因鼠

试验研究了转基因小鼠建立中的受精卵显微注射和移植，对获得受精卵、有效注射及移植易出现的问题和解决方法进行了讨论，对注射后的受精卵的移植加以改进，建立了人Ｇ－ＣＳＦ转基因小鼠模型．     

用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠

以慢病毒（lentivirus）载体为骨架，携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的假病毒，通过小鼠受精卵卵周隙注射，将其感染小鼠受精卵，经移植于假孕母鼠后获得转基因小鼠．应用PCR、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等技术，证明了GFP基因的整合率达到40%以上；实时定量PCR分析结果表明转基因小鼠中GFP基因整合的拷贝数约为40；染色体荧光原位杂交分析结果显示GFP基因在小鼠染色体上的整合是随机的，并通过交配可将外源基因遗传至子代，获得的多整合位点和不同表达水平的转基因小鼠具有明显的实际应用和研究价值．文中报道的慢病毒载体介导的转基因技术为高效制备和选育高表达转基因小鼠品系提供了一种有效的途径．     

基于Cre／Loxp系统Tyr03、Axl受体酪氨酸激酶转基因小鼠的建立

采用大肠杆菌β一半乳糖酶基因LacZ作为报告基因,建立Tyr03、Axl受体酪氨酸激酶含有loxp位点的转基因小鼠。与不同组织特异性Cre小鼠杂交,获得时空性表达Tyr03、Axl的转基因小鼠,为研究其在各个组织中的功能奠定基础。方法构建含有loxp位点的Tyr03、Axl受体酪氨酸激酶质粒,测序正确后,通过显微注射法将插入CAG启动子下游的Geo—STOP—msAxl及Geo—STOP—msTyr03基因的转基因载体注射入BDFI供体鼠受精卵,移植受精卵至ICR受体鼠,待产仔后,通过双引物PCR鉴定F。以及Fn代小鼠的基因型,RT—PCR,X—gal染色观察小鼠组织中LaeZ基因,运用WB（WesternBlot）检测转基因小鼠和野生型小鼠体内目的蛋白表达的差异。结果获得了含有目的基因的转基因阳性小鼠;通过RT—PCR对阳性小鼠证明LacZ基因的存在;对存在LacZ基因的小鼠进行X—gal染色,在Geo—STOP—msTyr03的脑、睾丸、胸腺中观察到蓝色沉淀,在Geo—STOP—msAxl的脑、心、肾中观察到蓝色沉淀,间接说明目的基因能表达的组织和器官;对双阳性的Geo．STOP．msTyr03、Geo．STOP—msAxl转基因小鼠和野生型小鼠,WB检验证实Tyr03、Axl基因的表达没有差异,说明在加入stop序列之后,Tyr03基因确实存在,而且表达受到抑制。结论成功建立Geo-STOP—msAxl及Geo—STOP—msTyr03酪氨酸受体转基因小鼠。     

MicroRNA-122过表达转基因小鼠的建立

目的:建立microRNA-122 (mir-122)过表达转基因小鼠模型,为今后研究肝脏发育,分化及肝癌预防、诊断及治疗等提供实验模型.方法:构建mir-122过表达载体,利用受精卵前核显微注射法将mir-122过表达载体导入小鼠受精卵中,获得mir-122过表达转基因小鼠.PCR法检测转基因小鼠的整合情况,实时定量PCR法检测mir-122过表达转基因小鼠肝脏及其主要器官mir-122及其确定靶基因高亲和性阳离子氨基酸转运体-1(CAT-1),切割同源物1(CUTL-1),血清反应因子(SRF)的表达情况.结果:mir-122过表达转基因小鼠,与同窝阴性鼠相比,mir-122在过表达转基因小鼠肝脏及主要器官中的表达升高,mir-122靶基因表达水平下降.结论:成功构建mir-122过表达转基因小鼠.     

Vill转基因小鼠的制备

摘要:目的　通过制备Vill转基因小鼠研究该基因的功能。 方法与结果　首先由RT-PRC方法获得全长约2605bp的Vill基因;经T载体克隆测序验证后,以克隆载体pMD19-T-Vill为模板,设计引物并引入酶切位点,将PRC扩增产物与pEF6/V5-His-LacZ同时进行酶切、连接,构建表达载体pEF6/V5His-Vill;经真核表达验证后,酶切获得含Vill基因的显微注射DNA构件;显微注射390枚受精卵后,在出生存活的77只仔鼠中获得转基因阳性GO代小鼠19只,其中16只能够稳定遗传并建系,转基因阳性小鼠外观未有明显改变。 结论　Vill转基因小鼠为该基因的功能研究准备了实验材料。     

乳腺生物反应器的研究现状

1980年Gordon将重组DNA采用显微注射方法导入小鼠受精卵,首次获得了带有外源基因的转基因小鼠,这是人类首次对哺乳动物进行人工改造的尝试。1982年Palmiter等将大鼠生产激素基因显微注射到小鼠受精卵中,首次获得了比普通小鼠大得多的“超级小鼠”,并提出可以从转基因动物中提纯有价值的药用蛋白。“超级小鼠”的诞生,说明了通过性细胞的基因操作可以有效地将外源基因导入哺乳类动物的基因组内,使其得以有效地表达,并产生相应的生理效应。这一结果的取得,标志     

Plcd1转基因小鼠的制备

通过制备Plcd1转基因小鼠研究Plcd1基因功能.首先逆转录PCR获得约2.2kb的Plcd1基因全长,T载体克隆后测序验证;以pMD19-T-Plcd1为模板,通过设计引物及PCR扩增引入酶切位点,与pEF6/V5-His同时进行酶切、连接,构建pEF6/V5-His-Plcd1表达载体;经真核表达验证后,酶切获得目标片段,显微注射681枚受精卵,在82只仔鼠中获得转基因阳性首建鼠15只,其中13只稳定遗传并建系.PLCD1-HIS融合蛋白在睾丸组织中表达,在皮肤组织中无表达.Plcd1转基因小鼠为Plcd1功能研究奠定了基础.     

小鼠转基因及传代研究

综述了湖北省农科院生物技术研究所近年来有关转基因小鼠的主要研究进展。应用原核注射技术 ,将POMT PGH、hDAF、pBHSA、pSHSA、PT HBV 1 3、Bcl xL、hCD5 9、hCD5 9+hMCP等 8种外源基因 ,注入并移植 4 874枚小鼠的受精卵 ,得到 5 5 6只小鼠 ;经PCR和Southern杂交检测 ,确认原代转基因小鼠 10 8只。基因整合率平均 19.4 % ,转基因效率平均 2 .2 %。应用混合注射的方法得到了转双基因小鼠 ,双基因共整合率 2 2 .2 %。表达外源蛋白的转基因小鼠在 5 0 %～ 10 0 %之间。研究了小鼠的超数排卵和影响转基因效率的几个因素。通过转Bcl xL小鼠与非转基因小鼠连续五个世代的传代交配和检测 ,研究了转基因小鼠外源基因的遗传规律 ,表明四只原代小鼠中 ,只有一只能稳定地将外源基因传递给后代。并非所有的转基因小鼠都具有遗传的稳定性 ,欲建立小鼠的转基因品系 ,尚需对原代转基因小鼠进行筛选。     

Pygo2转基因小鼠模型的建立及表型的初步分析

主要通过建立Pygo2转基因小鼠的模型对其表型进行初步分析.首先构建K14-2×flag-Pygo的转基因构件,经酶切、纯化后构建Pygo2转基因小鼠.出生后的仔鼠用PCR和Western方法检测基因型,并通过进一步的免疫组化验证Pygo2基因的表达.PCR检测获得7只转基因阳性鼠,6只Western检测为阳性.对转基因小鼠子代的胚胎和成体进行免疫组化证明,Pygo2基因在皮肤和乳腺组织中有过量表达.转基因小鼠的皮肤、乳腺以及鼠尾椎骨等组织出现了异常的表型.乳腺中有肿瘤组织的形成,且Pygo2在肿瘤中有大量表达.该模型的成功建立为进一步研究Pygo2的功能奠定了基础.     

脑组织特异性表达胰岛素样生长因子-1转基因小鼠制备

目的制备脑组织特异性表达胰岛素样生长因子-1(Insulin-Like Growth Factors 1,IGF-1)转基因小鼠。方法采用精子为载体法进行基因转导,出生后小鼠PCR检测,建立转基因小鼠系,用Western blot和免疫荧光法分别检测转基因小鼠海马齿状回亚粒状区(subgranular zone,SGZ)IGF-1表达量和报告基因EGFP阳性细胞数。结果获得3只阳性小鼠,2只外源基因能稳定遗传,并建立了转基因小鼠系,转基因鼠SGZ区域IGF-1表达量显著高于正常鼠,EGFP也在此区域表达。结论成功制备IGF-1转基因小鼠。     

日本沼虾受精卵的离体培养及其胚胎发育的初步观察

本文报道了日本沼虾的受精卵离体培养实验，并初步描述了其胚胎发育的特征。结果表明：日本沼虾受精卵以及各期胚胎（即卵裂期、囊胚期、原肠期、无节幼体期、后无节幼体期、前蚤状幼体期的胚胎）分别离体培养，均可孵化出蚤状Ｉ期幼体；并且离体受精卵及各发育时期胚胎与亲虾所抱受精卵和相同时期胚胎发育同步。日本沼虾的卵裂方式属于完全卵裂和表面卵裂之间的过渡类型     

四川白鹅和豁眼鹅在武汉繁殖性能比较

从四川南溪县、山东莱阳市分别引进四川白鹅和豁眼鹅,在武汉地区进行饲养对比试验,分析两个不同品种在武汉地区气候条件下的繁殖性能.结果表明:四川白鹅,开产日龄263 d,产蛋持续期160 d,只均产蛋数64枚,均蛋重135.77 g,产蛋率40%,受精率86.0%,受精蛋孵化率85.8%;豁眼鹅,开产日龄298d,产蛋持续期118d,只均产蛋数38枚,均蛋重122.98g,产蛋率32%,受精率84.0%,受精蛋孵化率84.9%.二者受精蛋孵化率差异无统计学意义(P>0.05),其他指标差异有统计学意义(P<0.05).实验数据说明,在武汉地区气候条件下,四川白鹅的繁殖性能优于豁眼鹅.     

蕨雌性生殖器官发育的初步研究

以蕨为实验材料，利用电子显微镜研究颈卵器的发育过程，报道了颈卵器发育过程中各种细胞的超微结构变化，蕨孢子接种后，约28d颈卵器表面原始细胞发生，并很快形成中央细胞，中央细胞分裂形成初生腹细胞和初生沟细胞，初生腹细胞进一步分裂形成卵细胞和腹沟细胞，卵细胞进一步发育，以卵细胞的细胞壁的增厚为标志，颈卵器发育成熟，颈卵器颈部顶端细胞打开，成熟的卵细胞准备受精。     

孵化器内的氧含量对受精种鸭蛋孵化率的影响

研究了提高孵化器内的氧含量对受精种鸭蛋孵化率的影响,结果显示:试验组入孵受精种鸭蛋的孵化率比对照组显著提高了1.13%(P<0.05).     

鮸鱼规模化繁育技术研究

通过鱼亲鱼培育、促熟催产、受精卵孵化、仔稚鱼生长变态,并成功繁育幼鱼103×104尾的生产实践,完成了鱼规模化繁育技术研究。对QZY添加剂在受精卵孵化中应用和仔鱼期鱼鳔异常胀大病作了初步探讨。     

克氏原螯虾受精卵结构观察

观察了克氏原螯虾受精卵的结构.取固定好的克氏原螯虾受精卵进行冷冻切片,苏木精-伊红染色,镜检,拍照.结果表明,克氏原螯虾受精卵属于中黄卵,细胞质被排挤到受精卵一侧,位于受精卵表面.受精卵有致密的中心区,由此向周围发散出呈指状突起的卵黄柱,卵黄柱内充满大小不等的卵黄颗粒.克氏原螯虾受精卵的结构可以通过冷冻切片观察.     

日本沼虾Macrobrachium nipponense（de Haan）卵子附着机制研究I．卵膜及卵子附着的扫描电镜观察

用扫描电镜技术观察了日本沼虾（Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍｎｉｐｐｏｎｅｎｓｅ）成熟卵、人工授精卵及自然受精产出附着于腹肢上的卵。成熟卵只有初级卵膜，表面较光滑，上密布微孔，密度约１～２个／μｍ２；人工授精卵表面首先突起大小不同的颗粒，随后颗粒破裂并消失，同自然受精卵一样，卵表略光滑，呈波浪状起伏，微孔密度与未受精前大致相同；自然产出的受精卵，表面覆盖一层由雌体腹肢分泌的次级卵膜。次级卵膜具有保护、选择性渗透及隔离邻近受精卵的作用。腹肢不断摆动，受精卵在腹肢间滚动并形成卵与卵之间以及卵与刚毛之间两种“卵柄”，一种称为卵索（ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ），不与刚毛相连。ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ扁带状，与卵接触处较宽，约１４０～１５０μｍ，中间宽约３０～４０μｍ；另一种称为卵柄（ｅｇｇｓｔａｌｋ），由１～２根载卵刚毛（ｏｏｓｅ－ｔａｅ）插入次级卵膜形成，与卵接触处次级卵膜突起呈锥状，基部宽约１４０～１５０μｍ。非载卵刚毛起辅助抱卵作用。     

鲈鲤胚胎发育特征观察

观察了水温（18±0．5）℃条件下,鲈鲤[Percocypris pingi pingi（ T chang ）]的胚胎发育特征。结果显示：成熟鲈鲤卵呈球形、桔黄色,为粘性卵,卵径2．2mm,卵膜遇水膨胀后,最大外膜径达3．2-3．8mm。受精卵在水温（18±0．5）℃条件下,受精2h28min后开始第1次卵裂,受精后45h23min开始形成器官,受精后126h28min孵出仔鱼。初孵仔鱼全长为10．4mm,卵黄囊大而侧扁。根据胚胎发育过程的形态特征,可将鲈鲤胚胎发育过程分为受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官发生和出膜7个连续阶段。32个时期。     

七彩神仙鱼胚胎及仔鱼发育研究

对七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciata)胚胎及仔鱼发育进行了研究,详细描述了发育各期的形态特征和所需时间.结果显示,七彩神仙鱼受精卵为红褐色粘性卵,在(29.0±0.5)℃时,孵化所需时间为52.5h.初孵仔鱼体长(3.52±0.19)mm,体高(1.27±0.07)mm,身体透明,头部粘附在产卵基上,尾部随着水流颤动.仔鱼出膜5d后亲鱼开始"奶子",到第13d基本发育完善.     

家鸭性别控制的研究

性激素处理受精卵和活性抗原物处理制种亲本生殖系统,对家鸭后代的性分化有显著影响。