家畜口蹄疫新型疫苗研制与生产工艺创新2014年度报告

<正>在研制的口蹄疫新型疫苗有10多种,分别是纳米微球黏膜免疫疫苗,表位肽疫苗、口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗、A型重组毒株(Re-A/WH/2009)的口蹄疫O型、A型、亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗、猪口蹄疫O型广谱基因工程病毒灭活疫苗、口蹄疫O型标记疫苗、猪O型Mya98毒株空衣壳疫苗、猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)、牛口蹄疫(O型、Asia1型)二价合成肽疫苗、以及口蹄疫病毒活载体疫苗。其中取得突破性进展的有5种,牛口蹄疫(O型、Asia1型)二价合成肽疫苗PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,已完成所有实验室研究和临床试验,申请了新兽药注册并已通过初审;猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,已完成所有实验室研究和临床试验,现已申请新兽药注册并通过复核试验和复审;含A型重组毒株(Re-A/WH/2009)的口蹄疫O型、A型、亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,获得了农业部新兽药注册证书,实现了产业化;猪口蹄疫O型广谱基因工程病毒灭活疫苗已申报农业部临床试验批文;口蹄疫O型标记疫苗已完成疫苗质量研究,并已申请新兽药注册。其他疫苗研究也均取得了程度不等的进展。利用反向遗传操作技术平台,获得基因工程修饰病毒疫苗株5株:(1)r V-STN-5;(2)9O/r V-1;(3)Re-A/WH/2009;(4)Re-Mya/98/BY/2010;(5)Re-Asia1/HN/2006。利用基因克隆、重组等技术,获得其他基因工程修饰病毒9株,分别为:(1)表达O型FMDV不同亚型主要免疫原性基因的重组伪狂犬病毒1株;(2)共表达O-A-Asia1型FMDV主要免疫原性基因的重组伪狂犬病毒1株;(3)表达FMDV免疫原性基因的杆状病毒2株;(4)表达猪源IFN-α/IFN-γ和A型FMDV P1基因的重组杆状病毒3株;(5)表达口蹄疫和小反刍兽疫病毒主要保护性抗原基因的重组羊痘病毒2株。成功研制Cp G-IFN、Cp G-IL4以及多磷腈和Cp G DNA等生物复合佐剂3种,纳米乳油佐剂、纳米粒IL-2佐剂以及多孔硅和上转换荧光纳米材料的载药系统等纳米复合佐剂材料4种,以及IL-2、IL-4和IFN-γ等多种哺乳动物细胞表达质粒和多糖类免疫增强剂4种。     

口蹄疫O型抗原(O/MYA98/BY/2010株)146S含量与疫苗免疫效力相关性研究

为了确定成品疫苗免疫效力达到6个PD50时,抗原146S最小含量,以及分析疫苗有效146S含量与百分保护率之间的相关性,将纯化O/MYA98/BY/2010株抗原分别按146S含量0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL配制成4批疫苗小样。4批疫苗分别重复三次进行免疫效力(PD50)测定,并对试验动物接种的有效146S含量与相关百分保护率进行线性相关回归分析。结果表明,抗原146S含量0.5μg/ml组三次试验PD50数分别为3.58、4.53、3.60;1.0μg/mL组三次试验PD50数分别为6.34、7.19、6.42;1.5μg/mL组三次试验PD50数分别为10.81、9.00、11.84;2.0μg/mL组三次试验PD50数分别为10.32、11.84、10.81。疫苗有效146S含量与百分保护率呈显著正相关,线性回归方程为y=50.533x+94.466,相关系数为0.90。以上结果说明,当抗原146S含量不低于1.0μg/mL时,所生产疫苗免疫效力在6个PD50以上。     

O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.     

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141~160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141~160aa-21~40aa-141~160aa(BTB),构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20~30nm大小的目的颗粒.     

鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的免疫保护期研究

选择免疫原性好的血清1,2,4型鸭疫里默氏杆菌（RA）分离株制备三价灭活油乳剂苗,疫苗抗原含量为5×109CFU/ml,分别用0.5,1.0和1.5ml/只剂量接种7日龄樱桃谷肉鸭以检验器其安全性;用0.25ml/只的剂量接种樱桃谷肉雏鸭,分别于免疫后第1、2、3,4、5和9周攻毒,以检验其免疫效果.安全性检验结果显示,肉雏鸭接种后未见局部和全身异常反应;攻毒保护试验结果显示,免疫后2～9周雏鸭对3个血清型的RA的攻毒保护率达70％ ～ 100％.证明该三价灭活疫苗具有良好的安全性免疫保护力,免疫保护期不少于9周.     

含T细胞表位和B细胞表位的抗O型FMDV基因工程疫苗诱导豚鼠产生免疫反应

用FMDV疫苗免疫接种是预防口蹄疫的主要手段之一 .研制既含B细胞表位又含T细胞表位的基因工程疫苗对口蹄疫的防治具有更强的保护能力 .用化学方法合成O型口蹄疫病毒 (FMDV)外壳蛋白VP1中 2 1～ 40位肽段的T细胞表位基因 ,与 1 41～ 1 60肽段的B细胞表位基因串联后 ,与 β 半乳糖苷酶基因相连 ,构建成一重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达出融合蛋白疫苗 .动物实验表明 ,该疫苗不仅能诱导豚鼠产生滴度很高的中和抗体 ,而且产生大量对病毒专一性T细胞 ,与不含 2 1～ 40肽段的疫苗相比 ,用该疫苗免疫的豚鼠血单个核细胞对FMDV的反应性提高 7倍以上 ,并能抵抗病毒攻击 .说明该疫苗可同时激活体液免疫及细胞免疫反应 ,有较强的保护作用 .     

猪O型口蹄疫母源抗体消长规律的测定和免疫效果观察试验

本试验测定了6窝母猪免疫后产小猪0、1、7、14、21、28、35、42日龄O型口蹄疫母源抗体消长情况和首免、二免免疫抗体测定。结果表明:未吃初乳的0日龄仔猪均无母源抗体,1日龄仔猪母源抗体滴度达到高峰,以后逐渐降低;口蹄疫母源抗体对1～14日龄的仔猪有保护,部分仔猪在21日龄还有保护。28～35日龄首免后21日其免疫抗体合格率低于70%,28日后达到峰值86.7%,一个月后再免一次,则有效免疫抗体水平可维持较长时间,以后逐渐降低,至5个月后已不能保护,种猪此时须再次免疫接种猪口蹄疫疫苗。     

三联疫苗对大黄鱼常见细菌性疾病免疫保护的实验研究

采用0.5%福尔马林4℃灭活和65℃热灭活2种不同的方法制备三联疫苗作为抗原,以多次腹腔注射或浸泡的方式免疫大黄鱼,通过测定受免大黄鱼血清中抗体凝集效价变化并进行攻毒实验以评估保护效果.结果表明:以福尔马林灭活疫苗注射免疫途径效果最佳,其血清抗体效价平均达1536,攻毒后1周内免疫保护率为88.9%;热灭活疫苗注射免疫途径效果也比较明显,其血清抗体效价平均达1024,攻毒后1周内免疫保护率为76.6%;福尔马林和热灭活疫苗浸泡免疫大黄鱼也有一定效果,免疫保护率分别为55.7%和44.6%.     

痤疮丙酸杆菌对小鼠抗胸膜肺炎放线杆菌血清7型9型的免疫保护

为明确痤疮丙酸杆菌(PA)对具有抗胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型和血清9型的异源免疫保护作用,对小鼠免疫PA分离株S14后,分别用APP血清7型(CCVC-265)和血清9型(CCVC-267)攻毒。结果表明,免疫保护率达60%和70%;而用猪抗PA血清免疫小鼠后以APP血清7型和血清9型攻毒,免疫保护率达100%。血清特异性抗体效价检测显示,PA免疫小鼠后,可诱导小鼠产生特异性的抗APP血清7型和9型的抗体,ELISA方法检测特异性抗体平均效价为1 800和2 800。PA对APP血清7型和9型的感染具有良好的保护作用。     

抗FMDV基因疫苗的研究进展

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪、牛、羊等偶蹄动物一种高接触性传染病.口蹄疫一旦爆发和流行,会使家畜生产性能降低,给养殖户造成重大损失,给公共卫生造成重大的影响.随着弱毒苗禁用和灭活苗的减少使用,新型疫苗的研究成为热点.自1990年首次出现基因疫苗的研究报道之后,基因疫苗已经成为疫苗研究领域中的一大热点,因此该文对近年来国内外口蹄疫基因疫苗研究的主要进展进行综述.     

LPB—ELISA对新生牛血清中口蹄疫抗体的检测

口蹄疫是由于口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的动物疫病,被国际畜疫局(OIE)列为A类传染病之首.为了掌握新生牛血清中口蹄疫抗体的情况,从而为口蹄疫疫苗企业提供不含该抗体的优质新生牛血清.本试验采用液相阻断酶联免疫(LPB-ELISA)方法对20个批号新生牛血清样品中口蹄疫O型和亚洲I型抗体进行了检测,其中O型病毒抗原对照平均D492nm值50%值(临界值)为0.432;亚洲I型病毒抗原对照平均D492nm值50%(临界值)为0.897;20个新生牛血清样品亚洲I型和O型的D492nm值均大于临界值,表明各样品均显阴性,来自没有感染口蹄疫病毒或没有接种疫苗的动物.     

海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的研究

用野外分离的海豚链球菌(Streptococcus iniae)海水菌株HD-1和淡水菌株TBY-1制备成含1×1010cfu/mL的灭活疫苗,以0.1 mL/尾的剂量对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)进行腹腔注射,免疫2次,测定免疫后1周、3周和5周免疫鱼血清中抗海豚链球菌的抗体滴度和相应菌株攻毒后的相对保护率,以评价海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫保护性.结果显示免疫鱼血清中抗体凝集效价在免疫后第3周和第5周呈显著性升高,且两种疫苗免疫血清存在明显的交叉凝集反应,说明HD-1和TBY-1抗原具有交叉免疫原性.在免疫后第4周,利用8倍半数致死量浓度(LD50)的海豚链球菌强毒菌株进行攻毒试验,结果显示:HD-1和TBY-1免疫组的死亡率分别为5%和0%,相对保护率分别为93.8%和100%;未经免疫的阴性对照组的死亡率分别为77.5%和62.5%.     

雏鸡感染堆型艾美耳球虫早熟株外周血T淋巴细胞的动态变化

8日龄雏鸡(免疫组)每只接种3×103个堆型艾美尔球虫(Eimeria.acervulina)早熟株孢子化卵囊,在第16日龄免疫组和不免疫攻毒组每只攻毒堆型艾美尔球虫强毒株孢子代卵囊5×104个,用а 醋酸萘酯染色法计数T淋巴细胞数量,得T淋巴细胞所占淋巴细胞的百分率。t检验结果表明,免疫攻毒组T淋巴细胞的百分率与不免疫攻毒组和空白对照组的T淋巴细胞的百分率差异极显著,显示该早熟株具有较好的免疫保护效果。     

生猪组合免疫技术的建立与推广研究

为了有效提高我市生猪免疫合格水平,防止生猪疫病发生和扩散,2010年9月-11月,防城港市动物疫病预防控制中心在本市1个规模养猪场进行生猪组合免疫技术对比试验。探讨猪瘟、猪口蹄疫和猪蓝耳病这三种疫苗的进行组合接种的免疫效果,观察是否产生相互干扰。结果表明,合理进行组合免疫接种能够有效提高免疫质量,减少疫苗浪费,并减轻基层动物疫病防治员的工作量,从而实现节省人力物力的目的,值得推广。     

伪狂犬病病毒主要毒力基因缺失后的免疫原性研究

本试验研究伪狂犬病病毒（PRV）基因缺失疫苗株D1、D2和D3的免疫原性．对4周龄仔猪按不同剂量分别肌注接种D1、D2、D3后,于7、14d后采血：14d后用10^7pFU强毒株PRVFa滴鼻攻毒所有试验猪,攻毒7d后检查PRV在猪体内器官的分布．基因缺失毒株接种后试验组仔猪体温略有升高,接种部位未发生炎性反应,不向外散毒．PRVFa攻毒后试验组的仔猪体温稍有升高但不超过40℃,对照接毒组连续4d均超过40℃、有1头出现明显神经症状并死亡．强毒攻毒后,各剂量免疫组散毒均为2～3d,而对照组、同居猪散毒均为5d．对照组10个器官组织（大脑、小脑、三叉神经、心、肺、肝、肾、淋巴结、脾和扁桃体）均检测出PRV;D1组除大脑、小脑、肺脏外均检测出PRV;D2、D3组除大脑、小脑外,其它均检出PRV．免疫组的保护率均为100％,对照组为75％．试验结果表明D1、D2和D3能对接种猪提供充分的保护;攻毒后疫苗接种猪都向外排毒,但散毒天数均远低于对照组且未从同居感染猪中分离出病毒;D1、D2和D3是具有高度免疫原性且接种安全的基因缺失疫苗株．     

含T细胞表位和B细胞表位的抗O型FMDV基因工程疫苗诱导豚 …

用ＦＭＤＶ疫苗免疫接种是预防口蹄疫的主要手段之一,研制既含Ｂ细胞表位又含Ｔ细胞表位的基因工程疫苗对口蹄疫的防治具有更强的保护能力,用化学方法合成Ｏ型口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）外壳蛋白ＶＰ１中２１～４０位肽段的Ｔ细胞表位基因,与１４１～１６０肽段的Ｂ细胞表位基因串联后,与β－半乳糖苷酶基因相边,构建成一重组质粒,并在大肠杆菌中表达出融合蛋白疫苗,动物实验表明,该疫苗不仅能诱导豚鼠产生滴度很高的中和抗体,     

禽大肠杆菌O18、O78分离株免疫保护机理的研究

以禽原性大肠杆菌Ｏ１８,Ｏ７８分离株制成超声波裂解铝佐剂灭活苗免疫１４日龄鸡,以相同或不同外膜蛋白（ＯＭＰ）型的Ｏ１８,Ｏ７８分离株攻毒,结果以Ｏ７８血清型内相同和不同ＯＭＰ型分离株间能获得最大保护,Ｏ１８血清型内相同ＯＭＰ型分离株间获得最大保护,而不同ＯＭＰ型分离株间不能保护,两个血清型的分离株间不率ＯＭＰ型是否相同,均缺乏保护,以间接ＥＬＩＳＡ试验,间接血凝试验分别测定了试验鸡针对大肠杆菌ＯＭ     

O型口蹄疫病毒VP1基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

旨在构建能够表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的重组山羊痘病毒(GPV),并以此为活载体疫苗,评估其免疫效力.将FMDV的VP1基因插入转移质粒pTKfpgigp中,构建重组转移质粒pTKfpgigp-VP1,并转染已感染GPV的羔羊睾丸(LT)细胞,产生重组GPV(rGPV),筛选纯化rGPV,检测rGPV在LT细胞中VP1基因的表达情况.将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘(GP)和口蹄疫(FMD)特异性抗体水平.结果表明,获得含有FMDV的VP1基因重组毒株rGPV/FMDVVP1,在LT细胞中VP1基因进行正常转录,其表达产物能与FMDV抗血清产生特异性反应.rGPV能诱导产生不同水平的抗GP和FMD的特异性抗体.可为FMD重组标记疫苗的研制提供参考.     

牛种布鲁氏菌2308紫外诱变株毒力检测及其对昆明系小鼠的免疫效果研究

为了检测牛种布鲁氏菌2308紫外诱变株毒力和免疫效果,本实验以S19疫苗株为对照,用牛种布鲁氏菌基因缺失株紫外线照射组(2308△rwbk A、2308△romp25和2308△rery)和非照射组(2308△wbk A、2308△omp25和2308△ery)分别侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,对小鼠巨噬细胞内的细菌进行计数评价毒力致弱情况;用牛种布鲁氏菌基因缺失株紫外照射组、非照射组以及S19疫苗株分别以1×107CFU/0.2 m L免疫4-6周龄昆明系小鼠,通过ELISA检测小鼠血清中布鲁氏菌Ig G抗体和IFN-γ细胞因子,同时分离脾脏,CFU计数布鲁氏菌胞内菌数量;用2308强毒株以3×108CFU/0.2 m L腹腔感染各组免疫10周后小鼠,脾脏CFU评价各受试组小鼠的免疫效果。结果表明:在细胞水平,紫外线照射后的布鲁氏菌基因突变株其CFU较紫外线非照射组有不同程度的下降,统计学分析无显著性差异(P0.05),但均高于S19胞内菌CFU;与S19疫苗株相比,2308△rwbk A和2308△rery紫外线照射组与其对应的2株紫外线非照射组在不同检测阶段,其Ig G和IFN-γ含量水平相当,但2308△romp25紫外线照射菌株组在第6、8周,其Ig G和IFN-γ含量均高于2308△omp25紫外线非照射菌株组和S19免疫组,统计学分析有显著性差异(0.01P0.05);攻毒实验表明:经过紫外照射的romp25缺失株产生的保护力高于其它未经过紫外照射的缺失株,但低于S19疫苗株免疫效果。结论:紫外诱变株romp25毒力进一步降低而且能够产生一定的保护效果。     

免疫鸡群新城疫病毒检测和分离的研究

以ＳＰＦ鸡抗新城疫病毒（ＮＤＶ）ＩｇＧ为包被抗体（５μｇ／ｍＬ）,兔抗ＮＤＶＶｅｒｏ细胞培养纯化毒ＩｇＧ为第二抗体（１∶２００～６００）,酶标记羊抗兔ＩｇＧ（１∶５０００）为指示抗体建立间接夹心ＥＬＩＳＡ,检测实验免疫鸡、攻毒鸡及现地免疫鸡口腔或泄殖腔外分泌物。结果表明：新城疫无毒力Ｖ４疫苗免疫后２ｄ,口腔内病毒抗原随机检出率为４／１０,第１０天为１０／１０;泄殖腔为０～１／１０,并持续１８ｄ以上。滴鼻攻毒后１ｄ,口腔和泄殖腔内病毒抗原检出率分别是８／１０和６／１０;第１３天,泄殖腔内病毒抗原检出阴性。ＮＤＶ灭活疫苗免疫６０ｄ后攻毒,第２天有７／２０口腔和８／２０泄殖腔检出阳性,并一直到攻毒后第１４天。非免疫对照鸡攻毒后第３天直到死亡时,口腔和泄殖腔均可检出病毒抗原。对各地临床上无任何症状的ＮＤＶ免疫鸡群检测发现,泄殖腔ＮＤＶ抗原阳性率０％～９．３％,分离到８株ＮＤＶ流行毒株,生物学试验证实这些毒株的毒力属中等毒力偏强或强毒。