中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

解淀粉芽孢杆菌α—淀粉酶基因的分子克隆及其在大肠杆菌中表达的初步研究

以大肠杆菌噬菌体λEMBL_3为载体克隆了解淀粉芽孢杆菌的α—淀粉酶基因。被克隆的α—淀粉酶基因能够稳定存在,并可以在E.Coli中表达。携有α—淀粉酶基因的重组体噬菌体λPAmy~(13)其高效价裂解酶活力可达14.0u/ml。在大肠杆菌中产生的α—淀粉酶与兔抗解淀粉芽孢杆菌α—淀粉酶血清有交叉免疫反应。但与解淀粉芽孢杆菌本身所产生的α—淀粉相比,其免疫反应的程度下降。     

酶制剂对浓香型白酒发酵过程中高级醇生成的影响

文章采用实验室模拟白酒固态发酵的方法,研究了酵母、糖化酶、蛋白酶和α-淀粉酶的添加量对高级醇生成量的影响。结果表明,适量添加糖化酶和干酵母可以降低高级醇产量,当酵母添加量(于投粮比)为0.8%时,高级醇产量降低了14.8%;糖化酶添加量为750 u/g时,高级醇降低了11.4%;但是,添加蛋白酶却反而增加了高级醇的产量,而添加α-淀粉酶却对高级醇产量没有明显影响。     

成孢延迟蛋白基因对枯草芽孢杆菌生物量和发酵酶活力的影响

探讨同种相噬对枯草芽孢杆菌内源酶发酵活力的影响.应用同源重组敲除的方法,构建了枯草芽孢杆菌168菌株的编码成孢延迟蛋白毒素前体的基因sdp C的knock-in突变株,比较了突变株和出发菌株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力.与出发菌株相比,突变株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力均显著提高,产酶高峰期酶活力提高23%.本研究结果显示,sdp基因突变不仅能够提高枯草芽孢杆菌的生物量,还能够提高其内源酶的发酵活力.     

食品用α—淀粉酶清液发酵新工艺的研究

从BF—7658α—淀粉酶生产用菌株出发。选育出的H19—7—34菌株能适应以淀粉的酶水解液、豆饼碱水解液和无机盐组成的清液发酵培养基和发酵过程中不补料的工艺。在5001罐二级发酵试验中,α—淀粉酶活力平均可达343u/ml。这种清液发酵新工艺所得发酵酶液具有杂质少,过滤速度快,便于精制,提取总收率高(68.8～83.8％),成本低等优点。     

绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。     

产嗜热性α—淀粉酶的嗜热脂肪芽孢杆菌的初步探讨

嗜热脂肪芽孢杆菌GR2是由嗜热脂肪芽孢杆菌CU21经诱变处理而获得的突变菌株。GR2菌株具有比出发株CU21高的最高生长温度;嗜热性α-淀粉酶的得率增加;并且不利用葡萄糖为主要碳源的性质。在连续培养中,GR2菌株的嗜热性α-淀粉酶得率随稀释率的增加或随培养温度的下降而增大,嗜热脂肪芽孢杆菌的克隆株GR2(PAT9)与GR2(PATHP9)的嗜热性α-淀粉酶得率比宿主CR2的嗜热性α-淀粉酶的得率高10倍。质粒PATHP9是由质粒PAT9经小型化后得到的。连续培养的结果表明,质粒小型化后,单位菌体的质粒的复制数增加,但基因表达效率下降。     

利用枯草芽孢杆菌发酵生产糖化酶的上游工艺研究

糖化酶-α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucan glucohydrolace),又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)],此酶作用于淀粉分子的非还原性末端,以葡萄糖为单位,依次作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖。此酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1,6-糖苷键的寡糖;作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。本产品广泛用于生产白酒、黄酒、酒精、啤酒;用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵;本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之,凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上,都可适用。糖化酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉等经深层发酵提炼而成,本文介绍的是利用枯草芽孢菌杆发酵来生产糖化酶的基本上游工艺过程。     

不同浓度的秋水仙碱对枯草杆菌产α-淀粉酶的影响

依次使用质量体积分数为0.01%、0.03%和0.05%的秋水仙碱诱变处理枯草芽孢杆菌,结果表明秋水仙碱抑制枯草芽孢杆菌的生长;枯草芽孢杆菌分泌α-淀粉酶的能力与秋水仙碱的浓度呈正相关.最后分析和探讨不同浓度的秋水仙碱对枯草芽孢杆菌分泌α-淀粉酶能力的影响及其作用机理,为选育优良菌株奠定基础.     

一株α-淀粉酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化

从湖南省长沙县养殖场牛胃秸秆发酵物中筛选获得了一株高产α-淀粉酶的菌株,命名为SCUEC8.通过对其形态学观察和生理生化特性,结合16S rDNA序列对比分析,初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).探讨了不同碳源、氮源、培养条件等因素对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株产酶的影响,结果表明：在培养时间为16 h、pH为6.0、培养温度为37℃、碳源为20.0 g·L^-1的麦芽糖、氮源为15.0 g·L^-1的胰蛋白胨、金属离子为1.0 g·L^-1的Mn²⁺时,枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和α-淀粉酶的活性较高.     

食品级α—淀粉酶清液发酵高活性菌株的选育

以枯草杆菌H_(19—7—34)为出发菌株,经紫外线诱变及热处理多次交替处理,获得高产稳定株43—9,该菌株在C/N为1.34,pH6.5～7.0,500ml的三角瓶装量30ml的清液发酵培养基中,用旋转式摇床,转速228r·p·m,37±1℃发酵64hrs,α—淀粉酶平均活性达到526u/ml,最高达550u/ml,比出发菌株提高53.3％,进一步降低了食品用酶的成本,有利于形成大规模工业化生产。     

氮离子注入选育耐酸性α-淀粉酶产生菌诱变效应的研究

利用低能(30keV)氮离子注入中温中性α-淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌BF7658,研究对其产耐酸性α-淀粉酶的诱变效应.结果表明,BF7658菌株存活率曲线是典型的"马鞍型"剂量-效应曲线,在"马鞍型"区域对应注入剂量50×1014～100×1014 ions/cm2下具有较高的突变率.通过诱变筛选到一株最适作用pH为5.0,较出发菌株的最适作用pH偏低一个单位的突变株,编号TUST743.该突变株产酸性α-淀粉酶的酶活为343U/mL.该酶在pH4.5和4.0条件下的相对酶活为61%和38%,说明此突变株所产酸性α-淀粉酶对低pH有较好的耐受性.经连续传代实验,表明该菌株遗传性质稳定.     

嵌合信号肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

为提高α-淀粉酶的分泌效率，将不同天然信号肽的N，H和C区进行组合，以期筛选出优于天然信号肽的嵌合信号肽。首先从天然信号肽库中筛选了适合解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分泌的天然信号肽，以其中4种天然信号肽（SPyvcE，SPyoqM，SPBglS和SPyobB）的H区替换信号肽SPsacB的H区，构建4种嵌合信号肽RSP1—RSP4指导α-淀粉酶的基因工程菌株。结果表明，适合α-淀粉酶的最适天然信号肽和嵌合信号肽分别为SPyoqM和RSP1，且RSP1指导α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌的分泌效率较SPyoqM提高27%，较具有相同H区的SPyvcE提高了3.6倍，较仅H区不同的SPsacB提高了2.07倍。嵌合信号肽构建策略是一种有效提高α-淀粉酶分泌效率的方法，可为其他蛋白质的高效分泌提供参考。     

澄清白果汁酶解工艺的研究

以白果汁的透光率为考察指标建立回归数学模型,并对试验结果进行方差分析,得到白果澄清汁最佳酶解工艺。试验中所选4个因素对白果汁透光率影响从大到小的顺序依次为：中性蛋白酶、酶解温度、糖化酶、中温α淀粉酶。其中,中温α淀粉酶与酶解温度、中性蛋白酶与糖化酶、糖化酶与酶解温度对白果澄清汁透光率的交互作用有显著影响。经分析,最佳工艺参数为：0.09 %中温α淀粉酶、0.113 %中性蛋白酶、0.078 %糖化酶、酶解温度63.5 ℃,此时白果澄清汁透光率可达65.88 %,验证值为65.65 %,显著高于酶解前的透光率。     

茅台酒曲中产淀粉酶细菌分离及性质

从茅台酒曲中分离出产α淀粉酶优良菌株,经鉴定为芽孢杆菌属。在这些菌株中,所产α-淀粉酶以中温型为主,最适宜温度在50~60℃之间,也分离到一株最适宜温度为80℃高温型酶的菌株。同时研究了发酵培养基中碳氮源比对一株芽孢杆菌酶活力的影响及酶活力与培养时间的关系,结果表明,当碳氮比为9∶4 5时酶活力较高,酶活力在生长周期稳定期后期到死亡期达到最高。     

枯草芽孢杆菌工程菌产耐酸性高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产耐酸性高温α-淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌株pWB-amyd/WB600,通过单因素筛选及正交实验进行发酵培养基优化,得到的最佳配方为(g/L):玉米粉20,蛋白胨30,CaCl20.5,Na2HPO48.同时对实验室摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了最佳培养条件:37,℃、pH 6.5、200,r/min摇床培养36,h,接种量为2%,装液量为30,mL/250,mL.在此优化条件下,耐酸性高温α-淀粉酶活力达到3,980,U/mL,是未优化条件下的2.1倍.     

几株微生物胞外水解酶间的相互作用

分离纯化了在发酵生产中常见菌株的α－淀粉酶及中性蛋白酶,并对其相互作用进行了研究。结果发现,解淀粉芽孢杆菌ＢＦ所产的中性蛋白酶,对α－淀粉酶的失活作用强于其它菌株,黑曲霉ｕｖ－１１所产α－淀粉酶对中性蛋白酶较其它菌株敏感,细菌中性蛋白酶对霉菌胞外酶的水解作用强于细菌之间的相互作用。     

提取果胶过程中双酶法去除马铃薯薯渣残余淀粉的研究

马铃薯渣中含有大量的淀粉,探索双酶法逐步水解马铃薯薯渣中的残留淀粉的研究,目的是解决马铃薯薯渣提取果胶的中性糖残留问题提高果胶纯度。结果表明,耐高温a-淀粉酶和高转化率糖化酶组合使用可有效的水解马铃薯薯渣中的残留淀粉,其最优工艺条件为：液化时耐高温a-淀粉酶的最适条件为,为pH为6.3,液化温度为95℃,加酶量为90u/g,液化时间为30min;高转化率糖化酶的最适条件为pH为4.3,液化温度为60℃,加酶量为198u/g,糖化时间为2.0h,在最适条件下,最终后续产品果胶的纯度上升至80%以上。     

原生质体诱变选育分解X光胶片的菌株

从厦门福达感光胶片厂的污水中分离到207株芽孢杆菌,其中一株显示了较强的分解明胶的能力.该菌经鉴定为巨大芽孢杆菌(Bucillus megaterium 207).用溶菌酶制备207菌的原生质体,经紫外线诱变获得一变异株(207—A5),产蛋白酶活力由830u/ml 提高到4731u/ml.     

耐酸耐温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的功能表达

兼顾大肠杆菌与枯草芽孢杆菌密码子偏好性,优化获得了1个耐酸耐温淀粉酶的基因amyCN1,并将其在大肠杆菌中实现了功能表达。纯化后的重组α-淀粉酶(AMY1)表征结果表明:在最适pH 5.5和最适温度75℃条件下表观米氏常数(Km)值和催化效率(kcat/Km)值分别为20.93 g/L和98.20 L/(g.s);低浓度的Co2+(1 mmol/L)可以提高30%的淀粉酶活力,Mn2+抑制了大部分活力,包括Ca2+在内的其他金属离子影响不显著;高浓度的EDTA(≥50 mmol/L)抑制其活力;生物信息学分析表明,AMY1具有α-淀粉酶家族典型的3-结构域分布,具有1个Ca2+结合位点和5个Zn2+结合位点,活性中心催化氨基酸残基D198和E222位于(β/α)8桶中β折叠片C端一侧。AMY1优良的低pH耐受性和耐温性,有助于木薯淀粉生产燃料乙醇工业液化与糖化同步发酵工艺的实现。