驱动蛋白Kif18A多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测

采用标签蛋白诱导表达纯化、蛋白质谱、Western Blot、免疫荧光染色等多种分子生物学与细胞生物学方法,探究了一种制备蛋白特异性多克隆抗体、检测抗体并且运用抗体获得蛋白翻译后修饰信息的实验思路.结果表明,使用这种方法可以高效地得到Kif18A的兔源多克隆抗体.得到的抗体血清可以很好地应用于Western Blot(蛋白免疫印迹)、Co-IP(免疫共沉淀)等分子生物学实验.将抗体血清纯化后可以应用于免疫荧光染色实验,并可以获得良好清晰的实验结果.此外,利用制备出的Kif18A特异性抗体对细胞内源性Kif18A进行Co-IP实验后进行质谱分析,得到了内源性Kif18A蛋白翻译后的修饰信息,为研究Kif18A蛋白的定位与功能奠定了良好的基础.     

重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化

根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体. 抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.     

重组SARS冠状病毒S蛋白的原核表达研究

目的克隆表达SARS冠状病毒的主要结构蛋白(S蛋白)。方法合成SARS冠状病毒S蛋白特异性基因片断并克隆入pET32a原核表达载体,转化BL21菌,经IPTG诱导高效表达得到重组S蛋白,并通过W estern印迹对重组蛋白质进行鉴定。结果重组蛋白质经镍柱亲和层析得到了部分纯化,免疫动物后得到SARS病毒的多克隆抗体。结论经E lisa检测,表达的重组S蛋白基本具备检测病人血清中抗SARS病毒IgG和IgM的能力,可进一步用于S蛋白功能研究与SARS诊断试剂盒的研制。     

σ^70因子抗体能特异性地识别其他转录因子

通过免疫印迹法研究了抗大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ因子的抗体对产气杆菌、金黄色葡萄球菌和不同生长阶段的无蓝色链霉菌细胞内蛋白质的免疫识别作用。结果表明,抗大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ因子抗体能特异性地识别上述微生物细胞内的一些蛋白质。在数量和种类上几乎完全与大肠杆菌相同。     

新基因Splt137在大肠杆菌中的表达及抗体制备

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltMNPV)ORF137全长基因 (Splt137)。将其克隆到原核表达载体pQE30上 ,并转化大肠杆菌M15 ,在IPTG诱导下表达了与预期相对分子质量相符的一个 2 7× 10 7的蛋白质 ,经过聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化 ,免疫家兔制备了抗Splt137抗体。Western免疫印迹分析表明 ,该抗体适合用作Splt137蛋白的进一步分析。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

密码子优化的H5亚型流感病毒HA基因重组质粒在哺乳动物细胞中的高效表达及其免疫原性的研究

为了提高流感病毒血凝素(HA)基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI-neo中,构建了真核表达质粒pCI-opti-HA.将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pCI-wt-HA分别转染Vero或293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和蛋白免疫印迹(WB)实验比较HA蛋白的表达量.将两种重组质粒免疫Balb/c小鼠,比较两者诱导的抗体产生水平.三次免疫后两周用强毒攻击,通过体温和体重变化评价两种重组质粒的免疫保护效果.IP-MA和WB实验结果表明:密码子优化后,HA蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高.酶联免疫吸附实验(ELISA)结果表明:小鼠免疫后密码子优化的重组质粒诱导的特异性抗体效价较高.攻毒试验结果表明:两种重组质粒均能够提供较好的保护.     

多头绒泡菌线粒体中肌动蛋白的免疫细胞化学鉴定

自多头绒泡菌(Physarum polycephalum Schw.)原质团中分离线粒体,以兔抗肌动蛋白抗体为一抗,荧光素标记的羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作二抗进行间接免疫荧光和蛋白质免疫印迹实验.结果显示,线粒体中含有与肌动蛋白抗体呈阳性反应的抗原.以兔抗肌动蛋白抗体作一抗,金颗粒标记的蛋白A作二抗进行的间接免疫电子显微镜实验结果进一步证明了肌动蛋白是多头绒泡菌线粒体的组成成分,并在线粒体中呈散在分布.     

德国小蠊Bla g 2的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用RT-PCR技术扩增德国小蠊Blag2基因,将其克隆进pET-41b载体.在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Blag2蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,得到相对分子量约74kDa的融合蛋白.通过亲和层析法纯化表达的GST-Blag2蛋白,并以此表达产物制成油乳剂疫苗免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体.间接ELISA法测得抗体效价达到1∶300000.Western印迹表明抗体有较高的特异性,可分别与GST-Blag2融合蛋白和德国小蠊变应原浸提液反应.Blag2在大肠杆菌中的成功表达及其多克隆抗体的制备,为德国小蠊过敏患者的诊断和治疗提供了帮助.     

草履虫的类中间纤维以免疫学方法进行的初步研究

以抗中间纤维蛋白抗体作为探针进行免疫荧光实验,得到细胞内不同部位的阳性反应,暗示原生质中可能存在类中间纤维。这些同源蛋白的胞内分布具有一定的规律性。进一步采用SDS-PAGE和免疫印迹技术研究它们的生化性质,发现4种主要蛋白明显有别于胞内其他蛋白组分。它们是21,23,33及68kD蛋白。在免疫印迹实验中,4种蛋白中的一种或几种分别与不同的中间纤维蛋白抗体有交叉反应。以上实验初步表明,草履虫细胞内存在高等生物中间纤维蛋白的同源蛋白。     

驱动蛋白Kif22多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测

为深入研究驱动蛋白分子Kif22在细胞内的功能,应用分子克隆技术构建原核细胞表达质粒p HIS8-Kif22C156和p GEXKG-Kif22C156,并在细菌BL-21中诱导表达HIS8-Kif22C156和GST-Kif22C156.用Ni-NTA琼脂糖结合HIS8-Kif22C156蛋白进行蛋白纯化,然后免疫新西兰大白兔制备特异性多克隆抗Kif22抗体;用谷胱甘肽琼脂糖结合GSTKif22C156蛋白进行交联,纯化多克隆兔抗Kif22抗体.蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光染色实验证明纯化的抗体可以特异性识别细胞中的Kif22蛋白,表明Kif22多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度.     

密码子优化的H5亚型流感病毒HA基因重组质粒在哺乳动物细胞中的高效表达及其免疫原性的研究

为了提高流感病毒血凝素（HA）基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A／Goose／HLJ／QFY／04（H5N1）流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI—neo中,构建了真核表达质粒pCI—opti—HA．将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pCI—wt—HA分别转染Vero或293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）和蛋白免疫印迹（WB）实验比较HA蛋白的表达量．将两种重组质粒免疫Balb／c小鼠,比较两者诱导的抗体产生水平．三次免疫后两周用强毒攻击,通过体温和体重变化评价两种重组质粒的免疫保护效果．IP—MA和WWWB实验结果表明：密码子优化后,HA蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高．酶联免疫吸附实验（ELISA）结果表明：小鼠免疫后密码子优化的重组质粒诱导的特异性抗体效价较高．攻毒试验结果表明：两种重组质粒均能够提供较好的保护．     

TMCO1蛋白2种不同亚型的表达分析

内质网钙离子通道蛋白TMCO1具有2个不同的亚型,分别表达239个氨基酸和188个氨基酸,而2种亚型在细胞中的表达还缺少研究论证.通过对氨基酸序列的分析,比较了2种不同亚型的结构域,并构建得到2种不同亚型的哺乳动物细胞表达载体.免疫荧光实验和蛋白质免疫印迹实验表明了2种蛋白亚型的亚细胞定位和表达,同时表明在哺乳动物细胞中,TMCO1的m RNA更倾向于在下游的起始密码子翻译.进一步通过RNA干扰实验发现敲低TMCO1的表达对细胞周期没有明显的影响.     

工程菌表达马铃薯钙调素(PCM 6)的抗体制备及鉴定

PCM6是马铃薯钙调素亚型中与其他植物钙调素在氨基酸序列上最为保守的一种，利用大肠杆菌表达系统，表达并纯化了这种蛋白，以纯化的重组马铃薯CaM(PCM6）蛋白为抗原，免疫新西兰兔，获得了高效价（1：16000）抗体，免疫印迹检测表明，制备的抗体与植物钙调素有特异性的免疫交叉反应。     

多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜细胞凋亡及VEGF-A的表达

目的:观察多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠子宫内膜细胞的凋亡情况以及VEGF-A的表达变化,探讨细胞凋亡及VEGF-A在PCOS子宫内膜发生功能失常的过程中的作用.方法:大鼠皮下注射硫酸普拉睾酮钠来构建PCOS模型,TUNEL法检测大鼠子宫内膜细胞凋亡情况、免疫组织化学法和蛋白质免疫印迹法检测VEGF-A在大鼠子宫内膜中的表达情况.结果:TUNEL结果显示PCOS组大鼠子宫内膜细胞凋亡率较对照组明显降低(P 0. 05);免疫组织化学结果显示VEGF-A在PCOS组大鼠子宫内膜腺上皮细胞中的表达较对照组明显减弱(P 0. 05);蛋白质免疫印迹分析显示PCOS组大鼠子宫中VEGF-A蛋白的表达较正常对照组明显降低(P 0. 05).结论:PCOS子宫内膜功能失常可能与子宫内膜细胞凋亡减少有关,VEGF-A表达下调可能是PCOS子宫内膜增生过度的一种代偿性作用.     

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INAIAP在肝癌细胞中的表达

为探究纺锤体蛋白INMAP的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP多克隆抗体。利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE及免疫印迹检测蛋白表达。4.0 mol/L尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度。以所获抗原免疫4只Balb/c小鼠,收集心脏抗血清。以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP多克隆抗体的特异性。通过免疫印迹分析INMAP在正常肝细胞系L-02及5个肝癌细胞系(PLC、Hep G2、SUN449、SMMC-7721和BEL-7402)中的表达差异。结果显示,His-INMAP融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%)。INMAP多克隆抗体能与INMAP抗原特异结合。INMAP在6种肝细胞中具有多态性,除PLC外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调。本研究制备的INMAP多克隆抗体特异性高,为INMAP基因功能的进一步研究奠定了基础。     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INMAP在肝癌细胞中的表达

 为探究纺锤体蛋白INMAP 的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP 多克隆抗体.利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP 融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE 及免疫印迹检测蛋白表达.4.0 mol/L 尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度.以所获抗原免疫4 只Balb/c 小鼠,收集心脏抗血清.以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP 多克隆抗体的特异性.通过免疫印迹分析INMAP 在正常肝细胞系L-02 及5个肝癌细胞系(PLC、HepG2、SUN449、SMMC-7721 和BEL-7402)中的表达差异.结果显示,His-INMAP 融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L 尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%).INMAP 多克隆抗体能与INMAP 抗原特异结合.INMAP 在6 种肝细胞中具有多态性,除PLC 外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调.本研究制备的INMAP 多克隆抗体特异性高,为INMAP 基因功能的进一步研究奠定了基础.     

海立啮齿杆菌OmpA的原核表达及免疫效果

目的 探讨海立啮齿杆菌(Rh)外膜蛋白A(OmpA)原核表达蛋白对小鼠的免疫效果。方法 采用原核表达、镍离子亲和层析纯化,制备Rh OmpA重组蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。获得的OmpA目的蛋白经腹腔、肌肉联合注射和滴鼻两种方案免疫ICR小鼠,由ELISA方法测定其抗体滴度。再分别将Rh ATCC12555、嗜肺啮齿杆菌(Rp)ATCC35149和Rh分离株PP320对免疫小鼠腹腔接种攻毒,评价重组蛋白OmpA对小鼠的保护效果。结果 以表达蛋白OmpA为包被抗原的ELISA方法检测免疫小鼠血清中OmpA特异性抗体水平,平均抗体滴度为19.84log₂。免疫小鼠对两标准菌株和PP320的保护率分别为60%、60%和80%,与未免疫小鼠相比死亡率显著降低(P<0.001)。基于OmpA表达蛋白建立的ELISA方法检测嗜肺巴斯德杆菌(Pp)阳性小鼠血清,抗体阳性率为60%。结论 制备的Rh OmpA表达蛋白有良好的免疫原性,对Rh和Rp具有一定的保护效果,为实验动物中呼吸道病原菌的防控提供参考。