小鼠肝炎病毒核酸快速检测方法的建立和应用

摘要: 为满足口岸对入境噬齿类动物快速检疫的需要,建立小鼠肝炎病毒( Mouse hepatitis virus,MHV) 快速核酸检 测方法。方法使用引物和TaqMan 荧光探针设计软件,针对MHV 保守基因设计引物和探针,建立了RT-PCR 和 Real-time RT-PCR 方法检测噬齿类动物临床样本中MHV 的方法。结果本研究建立的RT-PCR 和Real-time RTPCR 检测MHV 方法具有良好的特异性和敏感性,通过将建立的方法应用于MHV 阳性鼠临床样品的检测,证实两 种MHV 核酸检测方法具有良好的稳定性。结论本研究建立的RT-PCR 和Real-time RT-PCR 检测MHV 的方法, 适用于动物粪便、尿液等易于获得样本的检测。     

糯米酒发酵过程中微生物基因组提取方法比较

为了更加快速地获得糯米酒发酵过程中高质量的微生物基因组DNA,本实验通过测定基因组DNA浓度和进行聚合酶链式反应(PCR),利用溶菌酶-SDS-蛋白酶-K(A法),改良CTAB(B法)和改良CTAB-溶菌酶(C法)三种实验方法获得微生物基因组DNA,通过比较三种方法发现,C法提取效率最高,获得的基因组DNA浓度为1 573.97±711.51ng/μL;B法获得的基因组浓度为1 436.03±128.0ng/μL;A法效率最低,获得基因组浓度为411.67±133.29ng/μL.以基因组DNA为模板进行PCR,将扩增产物在0.6%琼脂糖凝胶中进行电泳检验.结果显示C法获得的条带最清楚明亮,表明DNA浓度最高、结构完整.基因组DNA浓度和PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带的亮度表明,提取糯米酒发酵过程中微生物基因组DNA的最优方法为改良CTAB-溶菌酶法(C法).     

油页岩微生物总DNA的提取方法

为建立油页岩微生物总DNA提取方法,以两矿区的6个样品为材料,采用SDS高盐、SDS液氮研磨、SDS反复冻融、SDS异硫氰酸胍和试剂盒提取法分别对总DNA进行提取.结果表明,各方法提取效果差异很大,改进的SDS高盐提取法效果最好,各样品均得到约23kb较完整片段,且产率显著高于其他方法,达9144~38685ng·g-1干样;以未纯化的DNA为模板,对16SrDNA进行PCR-DGGE,得到了相应的扩增产物及DGGE指纹图谱,说明该法适合油页岩样品.SDS液氮研磨和SDS反复冻融提取法仅能得到部分样品总DNA,且产率和纯度较低,而SDS异硫氰酸胍和试剂盒提取法无DNA提出,不适合此类样品.     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

DNA的不同提取方法对转基因产品定值的影响

国内外非常重视转基因产品的检测工作,主要依赖于DNA的PCR方法进行检测,其检测结果可靠、稳定、灵敏度较高。尤其在转基因产品的定值实验中,荧光定量PCR的应用起到重要的作用,但是DNA的质量是保证荧光定量PCR定值准确的关键。实验以100%的克螟稻为材料,用CTAB法、商品化的Promega、Qiagen以及TIANGEN提取试剂盒,分别提取克螟稻基因组DNA,经过核酸蛋白分析仪初步测定浓度、纯度以及离子浓度后,分别以水稻内源基因PLD和克螟稻特异性转化体引物及探针实施荧光定量PCR实验,以100%克螟稻为盲样实施定值,来确定一种更适合荧光定量PCR定值实验的DNA提取方法,最终确定Qiagen和TIANGEN提取试剂盒满足荧光定量PCR对100%的克螟稻标准物质定值实验的要求。     

荷花花瓣总RNA的提取方法

以荷花花瓣为材料,在比较CTAB-LiCl法和Trizol法的基础上,针对荷花花瓣富含多糖、多酚的特点,在RNA提取过程中加入去多糖步骤,改良了CTAB-LiCl法.结果表明,改良CTAB-LiCl法能有效地去除多糖,提取到的RNA 28 SrRNA亮度约为18SrRNA的二倍,A260/A280比值为1.98,A260/A230比值为2.36,RNA产率为685.3ng/μL,说明利用改良CTAB-LiCl法从荷花花瓣中提取的RNA质量好、产率高、完整性好.     

不同类型DNA提取试剂盒提取牦牛乳粉DNA效果的比较

以牦牛乳粉为材料,采用了细胞/组织/血液基因组提取试剂盒、植物基因组提取试剂盒及食物核酸提取试剂盒3种不同类型的DNA提取试剂盒提取牦牛乳粉的基因组DNA,使用核酸和蛋白质分析仪检测后表明3种提取方法获得的DNA浓度相近;使用牦牛线粒体中细胞色素b的DNA序列特异性探针引物对所得的3种DNA进行实时荧光PCR,都获得了特异性扩增。结果表明3种类型的DNA提取试剂盒提取的牦牛乳粉基因组DNA都可以用于牦牛乳粉的分子特异性研究,综合提取操作的难易程度、耗时长短、成本高低及提取DNA的浓度分析,细胞/组织/血液基因组提取试剂盒为最佳选择。但食物核酸提取试剂盒的提取步骤简单,消解更彻底,更适用于一次性提取较多样本的基因组DNA。     

唇鱼骨基因组DNA提取与ISSR-PCR的优化

以唇鱼骨为材料,分别采用4种不同方法(CTAB法、SDS法、ROSE法及试剂盒)提取基因组DNA,并对影响PCR反应的模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶浓度等主要因子进行了优化,建立了适合唇鱼骨基因组DNA的ISSR-PCR反应体系.25μL的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:约60 ng模板DNA,1.2 U Taq酶,0.4 μrnol/L引物,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,2%甲酰胺.结果表明,利用优化反应体系对4种不同方法提取的DNA进行PCR扩增,均能得到较好的PCR扩增条带,以试剂盒法最佳,为淡水溪流性同属鱼类遗传多样性分析奠定了技术基础.     

果蝇基因组DNA的大规模提取及其RAPD-PCR反应条件的优化

介绍了一种大规模提取高质量果蝇基因组DNA的方法，该法不需液氮研磨，不需匀浆转移，不需高速离心，全部操作在3个1.5μL离心管中完成，所以特别适用于对不同果蝇品系等多样本的大规模提取，以本法提取的DNA为模板建立了RAPD－PCR分析的最佳反应体系，获得了稳定而理想的扩增效果，特别适用于小型昆虫的群体遗传多样性研究。     

样品保存温度和时间对总RNA提取的影响

目的:保障提取总RNA质量的前提下探索一种保存样品的适宜方法。方法:Trizol法(试剂盒)提取缺血复灌后肾组织总RNA。缺血45分钟后再灌注的大鼠肾脏,按照不同保存方法将样品分成四组,第一组液氮处理后立即提取总RNA;第二组-20℃冻存1天后提取总RNA;第三组-20℃冻存1周后提取总RNA;第四组液氮处理后1周后提取总RNA,然后检测各组RNA含量。结果:第一组RNA含量最多,第三组提取总RNA的含量最少。结论:提取总RNA的肾组织样品最佳保存方法是获得组织后立即提取总RNA,或者经液氮处理后保存在-20℃,一周后仍可获得较多含量的总RNA。     

卵细胞体外成熟(IVM)在小鼠生物净化中的应用

目的 在小鼠生物净化中,从超排后未排卵的卵巢,取卵泡内未成熟卵采用卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)使之在体外成熟并具备受精能力,以提高卵子利用率和作为常规促超排失败的一种补救措施。方法 在小鼠生物净化中,取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢,在实体显微镜下划破卵泡挑选卵丘卵母细胞复合物(COCs),置于成熟液滴中在体外发育成熟。同时以注射PMSG和HCG后正常超排卵、只注射PMSG后取未成熟卵体外成熟和注射PMSG和HCG后取疑似成熟卵和裸卵体外成熟作为对照。经体外受精、体外胚胎发育后,将2-细胞胚移植到受体输卵管,使其在受体内发育成为成熟的个体。结果 注射PMSG和HCG后未排卵组(A组),卵细胞体外成熟率为87.0%±3.2%,二胞率为55.1%±12.3%,囊胚率为23.1%,移植41枚二细胞胚至2只受体鼠,出生5只幼崽,产仔率12.2%。只注射PMSG,48 h后取未成熟卵组(B组),体外成熟率为83.9%±3.9%,二胞率为51.8%±9.3%,囊胚率为38.5%±13.9%。注射PMSG和HCG正常超排组(C组),其二胞率为78.9%±0.6%,囊胚率为78.0%±3.8%。注射PMSG和HCG未排卵卵巢,取裸卵和疑似成熟卵(D组),体外成熟培养0 h,6 h和16～18 h,其成熟率、二胞率和囊胚率与其它三组相比均较低且有极显著性差异。A组和B组与正常对照C组相比,二胞率均有显著性差异,囊胚率均有极显著性差异。结论 卵母细胞体外成熟(IVM)可以作为小鼠生物净化中促超排失败的一种补救措施,并且可以提高珍稀品系小鼠的卵子利用率。     

杭州湾滨海湿地生态安全动态变化及趋势预测

【目的】受人类活动干扰,滨海湿地日益突出的生态问题已经对区域可持续发展构成了严重威胁,明确滨海湿地的生态安全状态及变化趋势至关重要。笔者对杭州湾滨海湿地的生态安全状况进行评估和发展趋势分析预测,为湿地的有效管理、区域可持续发展,以及滨海湿地生态安全趋势的准确预测提供参考。【方法】基于DPSIR概念模型, 从驱动力、压力、状态、影响和响应等5个层面选取46个相关指标构建杭州湾滨海湿地生态安全评价体系。基于遥感数据、湿地监测数据、地理辅助数据、社会经济等统计数据获取各指标数据。分别对正负向指标进行标准化处理,使用熵值法计算各指标的权重,建立加权判断矩阵,确定各指标的正负理想解。根据各指标与理想解之间的距离,计算贴近度,即生态安全值,并划分为安全、比较安全、预警、脆弱、极度脆弱等5个等级。分别计算2000、2005、2010及2015年的生态安全值,使用灰色预测模型GM(1,1)对2020年杭州湾滨海湿地的生态安全值进行预测分析。【结果】根据熵值法改进的TOPSIS模型计算得到杭州湾滨海湿地在2000、2005、2010和2015年的生态安全指数分别为0.413、0.382、0.287和0.582,安全等级由预警等级恶化到脆弱等级,又恢复到预警等级,呈下降后上升趋势。熵值法计算的指标权重表明,湿地保护率、景观多样性指数、生活污水排放量、大气调节、长效机制构建、固碳、文教科研、人口增长率、旅游休闲、人均GDP、工业废气排放量和水源涵养是影响杭州湾滨海湿地生态安全的主要因素。杭州湾滨海湿地的DPSIR模型中,“驱动力”一直处于预警状况,但其面临的“压力”越来越大,从安全状态恶化到极度脆弱状态,“状态”不容乐观,从比较安全恶化到极度脆弱后好转,处于脆弱状态,“影响”基本处于预警状态,当地对湿地生态安全的“响应”从无到有,并稳步提高,有效地改善了滨海湿地整体生态安全状况。通过灰色预测模型 GM(1, 1)预测得到 2020 年杭州湾滨海湿地生态安全值为 0.697,处于“比较安全”的状态。【结论】经济快速发展,城市化加快和污染负荷加剧,导致杭州湾滨海湿地生态安全恶化; 随着政府及民众对湿地的广泛关注和重视,环保投入资金增加,构建了湿地保护长效机制,杭州湾滨海湿地生态安全状况逐渐改善,但仍处于安全预警状态。随着湿地保护力度增加,预计2020年杭州湾滨海湿地的生态安全状况将进一步好转,提升到比较安全状态。     

东南景天SaWRKY7基因对镉胁迫的响应研究

【目的】镉对植物具有高毒性,WRKY转录因子广泛参与植物逆境胁迫。研究镉诱导下WRKY基因的胁迫响应和抗性机制。【方法】以超积累型东南景天为试材,通过PCR克隆得到1个东南景天WRKY转录因子家族基因序列,结合生物信息学方法,分析其蛋白质结构和亲缘关系,构建GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白,观察其亚细胞定位,利用酵母验证其转录激活活性,通过qRT-PCR分析在镉胁迫下该基因的表达特性和组织特异性。【结果】获得了1条新的东南景天WRKY转录因子家族基因并命名为SaWRKY7,包含完整的开放阅读框,长度为1 011 bp,共编码336个氨基酸,为WRKY基因家族Ⅱd成员。SaWRKY7定位在细胞核,属于核蛋白,不具有转录自激活活性。SaWRKY7在东南景天的根、茎、叶中均有表达,且在根中相对有较高的表达量。与对照相比,在100 μmol/L CdCl₂处理0.5 h时,SaWRKY7在根茎叶中有较高的表达量,随后逐渐降低,属于早期诱导表达基因。【结论】SaWRKY7为WRKY转录因子家族成员,该基因定位在细胞核,不具有转录自激活活性,在早期响应镉胁迫诱导表达,推测其可能在东南景天镉积累或镉耐受过程中发挥重要作用。     

基于森林资源清查的江西省森林碳储量及固碳潜力研究

【目的】根据江西省森林资源清查数据,分别估算不同森林类型的生物量碳库及其变化,并估算森林植被的固碳潜力,为森林资源的科学管理提供理论依据。【方法】基于江西省1988—2011年森林资源清查统计数据,采用生物量换算因子连续函数法和平均生物量法,计算江西省森林植被的碳储量变化、碳密度及固碳潜力。【结果】1998—2011年江西省森林碳储量呈增长趋势,从81.38 Tg增长至188.52 Tg,年平均增长率达到3.7%; 江西省森林碳密度远低于全国平均水平,不同起源和植被类型的碳密度有较大差异,天然林的碳密度比人工林的高; 江西省森林植被碳汇潜力巨大,通过林业生长和再造林,固碳量可达191.48 Tg。【结论】江西省森林面积及碳储量呈较快增长趋势,但与全国平均水平比较,碳密度仍处于较低水平,主要原因在于江西省森林以幼龄林为主,这也预示随着后续的植树造林和森林生长,江西省的森林碳汇潜力较大。     

拉布拉多犬与金毛寻回猎犬基因组中与髋关节发育不良相关基因COL6A3、FN1的SNP位点检测

目的 检测拉布拉多犬与金毛寻回猎犬基因组DNA中与髋关节发育不良密切相关的COL6A3基因、FN1基因中的3个SNP位点,以期为拉布拉多犬与金毛寻回猎犬幼犬的选育提供有效的遗传学诊断方法。方法 全国范围内募集经过影像学诊断的髋关节发育不良的拉布拉多犬8只、金毛寻回猎犬5只,中国导盲犬大连培训基地提供经影像学诊断的健康的拉布拉多犬23只、金毛寻回猎犬7只作为实验对象,静脉采血,提取血细胞的基因组DNA样本,采用PCR/测序方法对COL6A3基因上的2个SNP位点(CFA25∶51031100,51040259)和FN1基因的1个SNP位点(CFA37∶25095511)进行基因型检测,并统计分析SNP位点的基因型与髋关节发育不良的关联度。结果 COL6A3(CFA25∶51031100,51040259)和FN1(CFA37∶25095511)SNP位点的基因型与犬的髋关节发育不良没有显著相关性(P>0.05)。结论 COL6A3(CFA25∶51031100,51040259)和FN1(CFA37∶25095511)SNP位点均不能成为拉布拉多犬与金毛寻回猎犬髋关节发育不良的实用性遗传学诊断指标。     

抗松材线虫病马尾松体胚发生与植株再生条件的优化

【目的】为使抗松材线虫病马尾松(Pinus massoniana Lamb.)快速大规模繁殖,对抗性马尾松体细胞胚胎发生和植株再生条件进行优化。【方法】以抗病马尾松未成熟合子胚为材料,探讨胚性愈伤组织的诱导、增殖与维持、分化成熟以及萌发的合适培养条件,并对体细胞胚进行生根诱导,对再生植株进行壮苗培养以及驯化移栽。【结果】以LP为基本培养基,添加2.0 mg/L 2,4-D(二氯苯氧乙酸)和1.0 mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤),抗性马尾松胚性愈伤组织诱导率最高达27.8%。在胚性愈伤组织增殖维持过程中,悬浮培养中的增殖系数和同步化程度都显著高于固体培养,且经过悬浮培养的细胞系分化能力更强。萌发过程中只有少量能顺利分化出根系,未能顺利分化出根的体胚于添加适量 IBA和 NAA的生根培养基中能够更好地生根。壮苗培养过程中,添加0.01 mg/L油菜素内酯有助于体胚苗的生长。体胚苗在驯化移栽时不同大小的苗移栽成活率相差较大,5 cm左右的体胚苗成活率最高达90.3%。【结论】生长素2,4-D和6-BA组合(2.0 mg/L和1.0 mg/L)对抗性马尾松胚性愈伤组织诱导率较好; 悬浮培养后的细胞系更利于诱导体胚,适宜浓度的IBA和NAA(1.0 mg/L和0.2 mg/L)能够促进体胚苗根系生长。在壮苗培养基中添加适量油菜素内酯能够促进抗性马尾松再生植株的生长,待苗长至5 cm左右移栽较好。     

日本落叶松全同胞家系苗期生长性状遗传变异

【目的】研究日本落叶松全同胞家系苗期生长性状遗传变异,为日本落叶松遗传改良提供可靠依据。【方法】以67个日本落叶松全同胞家系树高和地径为材料,对树高和地径进行方差分析、遗传参数分析、相关性分析、配合力分析以及家系选择。【结果】方差分析表明:各变异来源差异均达极显著水平(P<0.01); 树高和地径的表型变异系数分别为30.23%和21.51%,遗传变异系数分别为15.98%和16.99%。树高和地径的家系遗传力均为0.94,单株遗传力均为0.52; 通过一般配合力计算初选三棚04为优良父本,三棚37为优良母本,通过特殊配合力计算,东丰18 × 兰山25、东丰81 × 兰山25、三棚98 × 三棚74和临江34 × 兰山28杂交组合为优良组合。以树高和地径为评价指标,以10%的入选率进行优良家系选择,入选的7个家系树高和地径的平均值分别为0.70 m和1.06 cm,遗传增益分别为35.02%和29.01%。以2%的入选率进行优良单株选择,入选的50个单株树高和地径的平均值分别为0.98 m和1.35 cm,遗传增益分别为47.92%和34.67%。【结论】选出的7个优良家系和50个优良单株,可作为建立改良种子园和二代种子园的育种材料。     

稻壳炭改良盐渍土性状研究

【目的】为改善苏北沿海土壤性质,提高造林成活率,促进沿海防护林体系建设,将稻壳炭应用于盐碱土改良试验。【方法】将稻壳炭与土壤体积比例按照对照(0%)、2.5%、5%、10%、20%和30%分为6组,每组分别种植‘南林895’杨、女贞、弗吉尼亚栎、榉树和台湾杨。【结果】稻壳炭能有效降低土壤含盐量和密度,提高有机质含量,可使土壤含盐量、密度分别降低54.7%、26.1%,有机质提高162.0%,在稻壳炭与土壤体积比为10%时就可取得良好效果; 稻壳炭对土壤水溶性氮、速效磷和速效钾等营养元素具有吸附作用,在0～10 cm和10～40 cm土层土壤水溶性氮、速效磷和速效钾营养元素都是对照组最高或次高,加入稻壳炭后反而降低; 随着土壤中稻壳炭比例增加,造林成活率逐渐提高,当稻壳炭与土壤体积比为10%时造林成活率最高,达91.10%; 5个树种在盐渍土上的成活率和生长势大小为:‘南林895’杨>女贞>弗吉尼亚栎>榉树>台湾杨。【结论】稻壳炭在降盐改土方面具有良好作用,但对速效营养元素具有吸附作用; 稻壳炭能显著提高造林成活率,促进幼林生长,在稻壳炭与土壤体积比为10%时效果最佳。     

导盲犬和淘汰犬肠道菌群的差异性研究

目的 探究导盲犬和淘汰犬之间肠道菌群的差异,分析两者特征性差异菌群。方法 收集16只导盲犬和10只淘汰犬的新鲜粪便样本,按照犬品种和性别分为拉布拉多雄性导盲犬(GD-ML)和淘汰犬(ED-ML)、拉布拉多雌性导盲犬(GD-FL)和淘汰犬(ED-FL)、金毛雄性导盲犬(GD-MG)和淘汰犬(ED-MG),另外从中随机抽取9只导盲犬和4只淘汰犬分为导盲犬组(GD)和淘汰犬组(ED),共分为4组配对。提取粪便样本总DNA,应用PCR-DGGE技术获得肠道菌群图谱,应用相关软件和统计学方法对每组配对进行差异性分析。结果 聚类分析结果显示,GD和ED,GD-ML和ED-ML,GD-FL、ED-FL和GD-MG均各归为一类,表明导盲犬和淘汰犬之间肠道菌群存在差异。肠道菌群多样性、丰富度和均匀度分析结果显示,每两个配对组之间多样性指数、丰富度指数和均匀度指数存在差异,但差异均无统计学意义。差异性条带测序分析结果显示：与ED相比,GD Megamonas funiformis YIT 11815菌株增多;与ED-ML相比,GD-ML Succinatimonas hippei YIT 12066、Lactobacillus vaginalis DSM 5837、Lactobacillus acidophilus NCFM、Faecalibacterium prausnitzii A2-165菌株增多,Collinsella aerofaciens ATCC 25986和Prevotella copri DSM 18205菌株减少;与ED-FL相比,GD-FL Ruminococcus gnavus AGR2154、Fusobacterium russii ATCC 25533菌株减少;与ED-MG相比,GD-MG Tropheryma whipplei str. Twist菌株增多。结论 本研究发现导盲犬和淘汰犬肠道菌群存在差异,未来对差异菌群的进一步研究可能有助于辅助导盲犬的早期筛选。     

互联互通背景下巨灾对经济影响的全球性和复杂性的进展与展望

互联互通背景下,国际贸易作为连接各个国家和地区经济系统的纽带和桥梁,是巨灾经济影响跨区域传播的通道.该文通过对国内外相关研究的梳理,阐述了巨灾产生全球性经济影响的过程和机理.首先,从自然灾害等级的界定和巨灾的定义与划分着手,分析了近年来巨灾经济损失的发展趋势.其次,从间接经济损失的内涵与外延、灾害强度与经济影响的关联性、巨灾对性经济影响的区域差异性和全球化进程对巨灾间接经济损失的放大作用4个方面,分析了巨灾经济影响的多因素研究进展.再次,从巨灾经济影响的微观机制、巨灾的全球性经济影响机制、巨灾对宏观经济的影响机制、巨灾对全球经济生产的影响和巨灾对国际贸易的影响5个方面,分析了巨灾的全球性经济影响机制和过程研究进展.最后,从6个方面提出未来亟需加强的研究,以期对巨灾经济影的响全球性和复杂性有进一步的科学认识.