人重组内皮细胞衍生IL-8在大肠杆菌中高效表达

白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)是一种趋化因子,对中性粒细胞、T细胞有很强的趋化作用,并能活化中性粒细胞,因而IL-8在免疫调节和炎症过程中起着重要的作用。我们利用基因工程技术在大肠杆菌中表达出有生物活性的IL-8融合蛋白。     

经ibeB基因转染的鼠胚胎干细胞分化的研究

ibeB是一个致脑膜炎大肠杆菌K1株中参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的基因. 以ibeB基因转染鼠胚胎干细胞, 结果表明, 大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白IbeB不但具有“侵袭”功能, 而且可诱导真核细胞向神经样细胞分化, 经ibeB基因稳定转染的鼠胚胎干细胞能特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin. GFP标记的活细胞观察显示外源性IbeB蛋白定位于细胞核. 上述结果提示ibeB基因可能在调控nestin表达过程中发挥功能, 这为研究nestin基因的表达调控提供了资料.     

中间脉孢霉谷氨酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌和烟草中的表达

用谷氨酸脱氢酶（GDH）提高植物氮肥利用率是国际上生物工程研究的热点之一,通过RT－PCR方法克隆了真菌中间脉孢霉（Neurospora intermedia,简称Ni),好食脉孢霉（N.sitophila),粗糙脉孢霉（N.crassa)的gdh基因,进行序列测定,前两种gdh基因的序列为首次报道。分别将上述gdh基因克隆入pET30a质粒在大肠杆菌中表达,纯化后进行酶活性及米氏常数（Km)测定,结果发现大肠杆菌表达的Ni-GDH具有更高的酶活性,其Km值在0．3－0．45mmol/L左右。选择Ni-GDH基因转化烟草,发现它能促进烟草在低氮水平下的生长。     

小麦黄花叶病毒72ku蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备

采用逆转录－ＰＣＲ方法,扩增获得小麦黄花叶病毒（ＷＹＭＶ）ＲＮＡ２上的７２ｋｕ蛋白基因,将其克隆到ｐＥＴ３０ａ（＋）上,构建了该基因的原核表达载体ｐＥＴＰ７２。ＳＤＳ－ＲＡＧＥ分析结果显示,经ＩＰＴＧ诱导,７２ｋｕ蛋白基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中得到高效表达。以含表达产物的凝胶作为抗原,免疫家兔,首次制备了小麦黄花叶病毒ＲＮＡ２７２ｋｕ蛋白特异性抗血清。     

人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素基因的克隆和表达

毒素源性大肠杆菌(ETEC)是引起婴儿及旅游者腹泻的重要致病菌,其毒力因子主要有粘附素和肠毒素。后者又分为热敏感肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST),是引起腹泻的直接因素,因此,其研究具有重要意义。我们在提取ETEC H 10407株LT编码质粒的基础上,克隆和表达了其LT基因,并对LT-B编码基因即tox B基因作了进一步研究。     

重组蓝细菌PsbF亚基形成β:β同源二聚体细胞色素b-559

所有进行放氧光合作用的生物都具有两个光系统-- 光系统Ⅰ和光系统Ⅱ. 目前所分离到的最小的有光化学活性的光系统Ⅱ含3个亚基: D1, D2和细胞色素b-559. 细胞色素b-559在光系统Ⅱ中的作用至今不明. 利用基因重组方法, 将Synechococcus sp PCC7002的psbF基因以融合基因形式在大肠杆菌中高效表达, 获得有氧化还原活性的细胞色素b-559. 用凝血酶处理除去N末端谷胱甘肽氧化还原酶后获得的PsbF亚基仍有氧化还原活性, 说明PsbF可在大肠杆菌中形成二聚体. 不论是融合蛋白还是PsbF二聚体, 其氧化态吸收光谱、还原态吸收光谱和二者的差示光谱同分离到的高等植物细胞色素b-559光谱相同. 氧化还原滴定显示,二者的氧化还原电位在50 mV左右. 上述结果对确定细胞色素b-559的亚基组成和蛋白在膜上的定位有很大帮助.     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中两个gcvA基因的鉴定及其特性

GcvA蛋白是LysR转录因子家族成员, 在大肠杆菌(Escherichia coli)中, 它激活编码裂解甘氨酸酶系(GCV)操纵子(gcvTHP)的表达, 这一过程受甘氨酸诱导. 在以前的工作中, 我们分别突变了苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中90个LysR家族转录因子, 并鉴定了突变株的表型. 本研究证明了苜蓿中华根瘤菌基因组中存在2个gcvA基因gcvA1和gcvA2; 苜蓿中华根瘤菌gcvTHP操纵子的充分激活需要它们的同时存在. gcvA1对gcvTHP操纵子的激活需要甘氨酸诱导, 而gcvA2对gcvTHP操纵子的激活则不需要甘氨酸诱导, 推测苜蓿中华根瘤菌中gcvTHP表达的调控机制与大肠杆菌中的不同. 进化分析显示, 很多原细菌中都存在GcvA蛋白, 而苜蓿中华根瘤菌的GcvA1和GcvA2与大肠杆菌的GcvA的亲缘关系很远, 这也许可以解释它们gcvTHP表达调控模式的不同. 研究结果为LysR基因家族的功能提供了新的线索.     

卵黄蛋白原启动子驱动的防御素基因在转基因按蚊中的高效可调控性表达

遗传修饰蚊虫, 使其不传播疾病或使蚊虫种群密度下降, 是一种控制蚊媒传染病的新策略. 该策略实施的前提是能够改造蚊虫的基因组, 使得效应分子在适宜启动子驱动下, 在转基因蚊中高效特异表达. 本研究旨在评价冈比亚按蚊卵黄蛋白原启动子驱动的中华按蚊防御素基因在转基因斯氏按蚊中的表达效果. 克隆冈比亚按蚊卵黄蛋白原启动子序列, 并将其与已克隆的中华按蚊防御素基因顺式插入穿梭载体pSLFa, 然后再插入转化载体pBac[3xP3-DsRedafm]的AscⅠ位点; 将重组质粒pBac[3xP3DsRed-AgVgT2-DefA]和帮助质粒phsp-pBac DNA显微注射入斯氏按蚊的虫卵. 通过观察G1代幼虫眼部的特异荧光筛选出两株转基因阳性品系; Southern blot证明, 防御素基因的表达元件以单拷贝的形式插入到蚊基因组中; RT-PCR分析显示, 防御素基因在吸血后雌蚊的脂肪体中得到了特异高效表达, 而且防御素的表达比较内源性卵黄蛋白原能维持较长的时间, 因此多次吸血后的防御素表达呈现出可调性非周期型, 这对其发挥抗病原作用非常重要. 结果表明, 按蚊属蚊虫的卵黄蛋白原启动子和防御素基因在不同种按蚊中功能保守, 可以作为转基因抗疟研究中的候选调控分子和功能分子.     

重组蓝细菌PsbF亚基形成 β∶β 同源二聚体细胞色素b-559

所有进行放氧光合作用的生物都具有两个光系统—— 光系统Ⅰ和光系统Ⅱ. 目前所分离到的最小的有光化学活性的光系统Ⅱ含3个亚基: D1, D2和细胞色素b-559. 细胞色素b-559在光系统Ⅱ中的作用至今不明. 利用基因重组方法, 将Synechococcus sp PCC7002的psbF基因以融合基因形式在大肠杆菌中高效表达, 获得有氧化还原活性的细胞色素b-559. 用凝血酶处理除去N末端谷胱甘肽氧化还原酶后获得的PsbF亚基仍有氧化还原活性, 说明PsbF可在大肠杆菌中形成二聚体. 不论是融合蛋白还是PsbF二聚体, 其氧化态吸收光谱、还原态吸收光谱和二者的差示光谱同分离到的高等植物细胞色素b-559光谱相同. 氧化还原滴定显示, 二者的氧化还原电位在50 mV左右. 上述结果对确定细胞色素b-559的亚基组成和蛋白在膜上的定位有很大帮助.     

为细胞“编程”的启示

<正>生物学博士贾斯汀·帕哈拉和加拿大生物艺术家、MITMedia Lab研究员朱丽·勒高特,在北京中学生物实验室带领同学们利用神秘装备"Amino"完成了有趣的合成生物学实验。实验的基本思路是:往大肠杆菌里导入从海洋生物中获取的各种颜色的荧光蛋白基因。如果新的基因在大肠杆菌中获得表达,大肠杆菌就会呈现出不同的颜色,也就表明大肠杆菌"编程"成功。     

牛朊病毒正常成熟蛋白的高效表达和二级结构分析

利用ＤＮＡ重组技术,将牛朊病毒正常成熟蛋白基因插入表达载体ｐＥＴ３０ａ,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＥＤ３）中高效表达。将表达产物（包涵体）用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解,用阳离子交换柱纯化,纯化产物复性后,进行质谱、圆二色谱（ＣＤ）以及Ｆｏｕｒｉｅｒ变换红外光谱（ＦＴＩＲ）分析。结果表明,所得牛肼病毒正常成熟蛋白的分子量为２３６３０ｕ,其二级结构主要由α螺旋构成,含少量β折叠。     

重组DNA的研究新进展

本世纪70年代初,美国科学家S. Cohen和H. Boyer等首次在体外成功地组建了具有生物功能的重组质粒,1974年,Morrow等将第一个真核基因即瓜蟾rRNA基因导入大肠杆菌,获得克隆,标志着重组DNA(rDNA)研究的开始。rDNA技术,是在试管内用酶及其他物质使不同物种间的DNA分子彼此结合,然后导入细胞内令其行使功能的技术。它涉及五个方面:1)DNA特异的剪切技术——获取目的基因;2)核酸分子杂交技术——鉴定未知核酸分子;3)DNA的分子克隆——目的基因的扩增;4)DNA顺序测定——确立基因的精细结构和功能的关系;5)目的基因的表达——产     

具有高比活性的新木聚糖酶XYNB的酶学性质研究及其编码基因的克隆和表达

纯化了橄榄绿链霉菌A1产生的胞外木聚糖酶XYNB, 并对其酶学性质进行了测定. XYNB具有优良的酶学性质, 最适pH为5.2, 最适温度为60℃, 比活性高达2869.78 U/mg, 对金属离子及EDTA和SDS等具有较好的抗性. 根据木聚糖酶成熟蛋白N端氨基酸序列测序结果设计引物, 克隆了此酶的成熟蛋白编码基因xynB. 基因全长576 bp, (G+C)含量为64.3%, 编码191个氨基酸, 理论分子量为20.839 kD, 是一种新的木聚糖酶基因. 构建了xynB表达载体并在大肠杆菌中得到了表达, 表达产物具有正常的生物学活性.     

大肠杆菌核糖体蛋白质L24基因(rplX)的一个新的点突变

大肠杆菌核糖体蛋白质 L24是核糖体50S 大亚基组装的起始蛋白质之一.L24蛋白质发生突变或缺失对细菌的生长速度和细菌体内50S 亚基的含量都有很大影响.本实验室曾报道在一株 L24突变体 T83(rplX)中,λN 基因的表达受阻,λQ 基因的表达基本正常,同时,λN 基因的 mRNA 合成正常,说明λN 基因表达是在翻译水平上受到了抑制.本文通过DNA 顺序分析确定了该 rplX 突变发生的位置是一个 GGT 密码子突变成了 GAT 密码子,     

水稻金属硫蛋白核基因的克隆及其序列特征

经ＲＮＡ杂交分析发现ｒｉｃＭＴ基因在水稻茎部高效特异表达,其表达是叶片中的１００多倍,暗示出该基因的５‘上游可能贮藏着１个高效特异表达的启动子。为了弄清ｒｉｃＭＴ基因的表达调控及启动子结构特征,从水稻基因组文库中筛选出ｒｉｃＭＴ的核基因克隆,并测出了４０８４ｂｐ序列,其中包括２９７０ｂｐ的５‘上游区,约６９０ｂｐ的转录区和４２０ｂｐ的３’下游区。     

真细菌型的细胞分裂位点决定因子CrMinD基因在衣藻中从叶绿体到核的成功转移

MinD蛋白是一种普遍存在的ATP酶, 在真细菌、古细菌以及植物叶绿体的分裂过程中发挥着关键的作用. 在已研究过的4种绿藻(Mesostigma viride, Nephroselmis olivacea, Chlorella vulgaris, Prototheca wicker-hamii)中, MinD基因均由叶绿体基因组编码. 但在拟南芥中, MinD基因由核基因组编码, 其蛋白定位于叶绿体并参与叶绿体分裂的调控, 说明在高等陆生植物中, MinD基因已经转移到核基因组. 然而, 对于在质体进化过程中MinD基因从叶绿体转移至核的机制还不清楚. 我们从单细胞绿藻(Chlamydomonas reinhardtii, 衣藻)中鉴定了一个核编码的MinD同源物CrMinD, 其在野生型大肠杆菌(E. coli)中的过表达会抑制细胞的分裂并导致丝状细胞的形成, 表明植物MinD蛋白在进化上的保守性. CrMinD-egfp在烟草和拟南芥中的瞬时表达确认了CrMinD蛋白在调节叶绿体分裂中的作用. 在已公布的所有陆生植物质体基因组序列中, 没有发现MinD的同源物, 说明MinD基因从质体转移至核这一事件在进化出陆生植物以前就已经发生了.     

金鱼草S核酸酶在大肠杆菌中的表达

在许多显花植物中,自交不亲和性由复等位基因构成的被称为Ｓ位点的单一遗传位点控制,在茄科、玄参科和蔷薇科中,迄今已知的唯一Ｓ位点编码的产物业类核酸酶,称为Ｓ核酸酶,为Ｓ位占类花柱中的产物,参与自交不亲和性的表达,作为研究和比较其三维结构的第一步,在大肠杆菌中成功地表达了具有生物活性的金鱼草的３种Ｓ核酸酶基因（Ｓ２,Ｓ４和Ｓ５）编码的核酸酶,结果表明这些基因的表达对Ｅ．ｃｏｌｉ的生长没有影响,为体外大     

MRP反义RNA对肺癌细胞耐药的逆转作用

肿瘤耐药是临床肿瘤治疗的普遍现象,大多数肺癌病人一般对化疗没有反应,而肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,死亡率很高,目前仍无良好的治疗方法,因此研究其耐药生物学对治疗至关重要.肺癌中非小细胞性肺癌(NSCLC)的化疗敏感率较低.除MDRI基因和GST-π基因作用以外,最近发现另一个基因MRP也与肺癌耐药密切相关.我们在研究阿霉素诱导肺腺癌细胞系的耐药株(GAOK)时发现MDRI基因反义RNA不能完全抑制其耐药表型,进一步研究发现GAOK细胞MRP基因也表达增高,为了研究MRP基因在GAOK细胞耐药中的作用大小,并探讨逆转其耐药的可能性,用逆转病毒载体将MRP基因反义RNA导入耐药GAOK细胞中,观察其对MRP表达及其介导的耐药性变化.     

大鼠乳酸脱氢酶辅酶结合结构域的克隆与表达

为了研究分离结构域的结构与功能关系 ,利用聚合酶链式反应 (PCR)方法分离出大鼠肌肉乳酸脱氢酶的N端编码1～163位氨基酸的辅酶结合结构域的基因片段 .此结构域分别在热诱导表达系统和融合表达系统中获得高效表达 ,两系统获得的单独结构域经N端序列分析表明表达正确 .有关辅酶结合结构域工作正在进行.     

可溶性人干细胞因子基因的克隆及表达

干细胞因子(SCF)是近年发现的一种新的细胞因子,该因子是c-kit原癌基因编码受体的配体,在机体造血等多种功能细胞的生长发育中起重要调控作用.国外临床前期和临床Ⅰ期的研究表明,SCF在治疗某些顽固性贫血,恢复放化疗后骨髓的造血机能及抗辐射损伤等方面具有潜在应用价值.本研究应用分子生物学技术,克隆了编码人可溶性SCF基因cDNA并在COS7细胞和大肠杆菌中成功地进行了表达,现报道如下.