阿特拉津氯水解酶基因的定点诱变和酶活力检测

阿特拉津氯水解酶(AtzA)是一种对除草剂的生物降解和环境净化有重要意义的酶．采用定点诱变方法将假单胞菌ADP株的atzA基因第832位碱基(鸟嘌呤)诱变成腺嘌吟，然后将其插入表达载体pET21b( )，并在大肠杆菌中表达．表达的蛋白特性研究表明：AtzA或AtzA—NK融合蛋白系水溶性蛋白，很容易通过Ni—NTA Magnetic Agarose Beads分离纯化．采用阿特拉津脱氯反应产生HCl而引起pH指示剂颜色改变的测定方法能方便地对其酶活力进行定量．酶活力结果表明，突变酶的比活力与假单胞菌ADP菌株的AtzA相比没有明显改变，暗示突变位点(第278位缬氨酸突变成甲硫氨酸)不是酶的活性中心或底物结合部位。     

折质定点诱变技术的进展

蛋白质定点诱变技术是研究基因表达、蛋白质结构与功能关系，蛋白质的稳定性及分子进化等的重要工具。已发展了大量诱变质粒ＤＮＡ特殊碱基的有效操作程序。所有的方法都按在体外用带有预先设计诱变部位的寡核苷酸与已知序列靶基因序列错配异源杂交、合成定点诱变的ＤＮＡ完成的。对具有代表性的Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ法、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｐｒｏｍｅｇａ法、Ｄｅｎｇ和Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ法进行了综述，并讨论了它们的优点和局限性。     

罗非鱼下脚料酶解产物中抗菌肽的初步研究

为了得到具有高活性的抗菌肽,开展罗非鱼下脚料的深加工利用,提高综合效益、减少环境污染。本研究以罗非鱼下脚料为原料,经过初步试验得出最佳酶解条件为:酶解温度为55℃,pH为9.0,底物浓度为10%,加酶量为4000Ug,酶解时间5h。酶解液在4℃下,以12000rpmin的速度离心20min,上清液经分子质量截留为1ku的超滤,获得分子质量小于1ku的粗肽组分。     

大肠杆菌诱导黄粉虫产生抗菌肽的提取及抑菌活性的测定

为了探究大肠杆菌对黄粉虫抗菌肽的诱导效果,采用不同方法处理的大肠杆菌诱导黄粉虫产生抗菌肽,经过诱导的黄粉虫于12、24、36、48、60、72 h时,分别粗提其中的抗菌肽,测定其浓度和抑菌活性,同时,统计了大肠杆菌诱导的黄粉虫体内细菌含量。结果表明:经诱导各个时间点的黄粉虫抗菌肽浓度均显著高于未诱导的黄粉虫组(P0.05),且在诱导48 h时产生的抗菌肽浓度最高,大肠杆菌和灭活大肠杆菌诱导黄粉虫产生的抗菌肽对3种细菌的抑菌直径均显著大于未诱导组,且对大肠杆菌抑菌力高于金黄色葡萄球菌和沙门氏菌(P0.05),大肠杆菌诱导48 h后的黄粉虫中细菌含量为9.5×10~4 CFU/g,低于国家规定标准饲料中细菌总数最低值2×10~6 CFU/g。提示,用大肠杆菌诱导黄粉虫能刺激黄粉虫产生高表达量的抗菌肽,并对大肠杆菌具有较强的抗菌性能且具有一定的安全性。     

ApiIa抗菌肽基因的化学合成,克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了ＡｐｉＩａ抗菌肽基因,全长为８０个核苷酸。它被分成４个寡核苷酸片段,分别在ＤＮＡ合成仪上的合成经分离纯化后的寡核苷酸片段经酶促连接,然后被克隆到分泌型载体质粒ｐＡＦＤ１０１上,经限制酶酶切,ＰＣＲ模板检测以及双链ＤＮＡ序列分析检测,证明合成的ａｐｉＩａ基因和设计的完全一致。     

蛋白质定点诱变技术的进展

蛋白质定点诱变技术是研究基因表达、蛋白质结构与功能关系，蛋白质的稳定性及分子进化等的重要工具．已发展了大量诱变质粒DNA特殊碱基的有效操作程序，所有的方法都按在体外用带有预先设计诱变部位的寡核苷酸与己知序列靶基因序列错配异源杂交、合成定点诱变的DNA完成的．对具有代表性的Hutchison法、Kunkel法、Promega法、Deng和Nickoloff法进行了综述，并讨论了它们的优点和局限性．     

鱼类抗菌肽研究概况

抗菌肽是一类具有抗菌活性的天然小分子多肽,是鱼类非特异性免疫系统的重要组成部分,本文对近年来多种鱼类抗菌肽的研究概况进行了综述。     

新型抗菌肽基因设计,合成及在酵母中的表达（Ⅱ）：抗菌肽AD基因在 …

将抗菌肽ＡＤ基因定向克隆到大杆菌－酵母穿质粒ｐＣＬＷＡ２的ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ位点上。构建成含抗菌肽ＡＤ基因的重组质粒ｐＣＡＤ,转化酵母宿主菌ＡＢ１０３。     

中国对虾抗菌肽成熟肽的cDNA克隆

利用RT－PCR、嵌套PCR（Nested PCR)和3’－RACE等方法，从中国对虾血细胞中克隆到1种抗菌肽基因片段，称为中国对虾肽（Chp）基因。此基因片段长543bp，开读框共有156个碱基，编码52个氨基酸。该基因所编码的氨基酸序列对应于凡那对虾抗菌肽成熟肽的序列，与其一致性为52－59％，相似性为61－73％，分子量为5652．4Da，理论等电点为9．76，带正点荷的氨基酸（Arg-Lys）为8个，不含带负电荷的氨基酸。上述这些特征（分子量较小，带正点荷）均为抗菌肽的普遍特征。     

锯缘青蟹抗菌肽Scygonadin基因的转录表达特性研究

Scygonadin是从锯缘青蟹生殖系统分离获得的一种抗菌肽,我们用Dot-blot检测了该基因在锯缘青蟹幼体(溞状幼体和大眼幼体)和成体锯缘青蟹(雄性和雌性)的鳃、甲壳、眼、血细胞、肝胰脏、心脏、肌肉、甲壳下皮层、胃和生殖系统等10个不同组织器官中的转录表达情况.结果显示,该基因仅在雄性生殖系统中转录表达.进一步分析该基因在性成熟雄性锯缘青蟹和远洋梭子蟹生殖系统中不同部位(精巢、输精管、贮精囊和射精管)的转录表达情况,结果显示,Scygonadin基因主要在性成熟锯缘青蟹的射精管中转录表达.     

定点突变技术在转氨酶改造中的应用

对定点突变技术进行简要介绍，并对此技术在改造转氨酶的活性、稳定性及底物特异性等方面的最新进展进行了综述。同时，也对定点突变技术的发展趋势进行了展望。以期能为该领域的研究人员提供有价值的参考。     

蛋白质分子的定点突变和化学修饰

回顾蛋白质工程研究及应用技术、手段和方法,分析定点突变及化学修饰在改造蛋白质分子结构与功能方面的异同。定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法与使用化学因素导致突变的方法相比,具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。     

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究

以已知晶体结构的Pseudomonas mesoacidophila MX-45菌株海藻酮糖合成酶（MutB）的晶体结构为模板,在SWISS-MODEL模建立谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）海藻糖合成酶的立体结构,并对初始结构作能量优化,通过氨基酸序列比对,选择TreS-glu保守区内的氨基酸R245、D247、E289、F244和保守区外的氨基酸A288进行定点突变,并对突变酶F244C、F244L、F244W、F244Y、A288G、R245X、E289X、D247N、D247E进行纯化和酶学性质研究,比较突变子对酶活性和热稳定性的影响。结果表明,R245、E289突变为其它的19个氨基酸后酶活力全部丧失,D247E和D247N也丧失酶活,F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力分别降低到TreS-glu的38%、24%、62%、64%和35%,A288突变成T288后没有酶活。与TreS-glu相比,F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低,F244Y的最适反应温度和TreS-glu相同,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G的最适温度提高到32℃。与TreS-glu相比,突变酶的最适反应pH值均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G的为7.5,比TreS-glu的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W的为6.5,比TreS-glu的8.0均下降了近1.5个单位。与TreS-glu相比,突变酶的热稳定性均有不同程度提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比TreS-glu的提高约1℃,F244L提高约2℃,F244C提高了近4℃。     

青霉素G酰化酶调节基因定点诱变的研究

构建了大肠杆菌中青霉素G酰化酶（PAC）的调节基因（pacR）翻译起始密码定点突变株。对突变后PAC的表达调控特征进行了研究，结果表明：突变株的pac基因表达后能正常加工成24ku、65ku的α亚基和β亚基；突变后，虽然PAC表达仍需要苯乙酸诱导，但是，可诱导性提高，形成低组成型表达，无葡萄糖有分解代谢物阻遏效应，因而pacR对PAC表达水平存在着影响，pacR基因是葡萄糖以及它的分解代谢物在分子水平上影响PAC表达的另一作用因素。采用突变株进行发酵生产中，PAC产量较亲株提高3倍，而且可以采用葡萄糖作为碳源，有利于改善PAC的生产。     

抗菌肽的研究及其在植物基因工程中的应用

抗菌肽是一类新型的抗菌物质,在低等生物到高等动植物有广泛分布．抗菌肽及人工合成的抗菌肽基因在植物体中可以被表达并具有杀菌活性,能够应用于植物抗病工程方面,从而提高植物的抗病性．本文简要介绍了抗菌肽的发现、分类、结构、作用机理、基因结构和基因改造,以及抗菌肽在植物基因工程中的应用．     

家蚕抗菌肽的一些性质及抗肿瘤活性

由Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１诱导的家蚕血淋巴中提取的抗菌肽对热稳定，高温高压处理３０分钟仍保持原有活性。抗菌肽对木瓜蛋白酶不敏感，对蛋白酶Ｅ较敏感，而对蛋白酶Ｋ和胰蛋白酶则极为敏感，抗菌肽对ＰＨ的变化较为稳定，在ＰＨ２．２－８．０的范围内活性基本不变，肿瘤模型实验观察到免疫血淋巴对宫颈瘤有明显的抑瘤作用。抗菌肽与Ｋ５６２人髓样白血病细胞混合培育一定时间后，电镜观察可看到细胞膜和细胞器发生明显变化，最     

K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶基因的定点突变及其性能研究

针对菌株K.pneumoniae XJPD—Li高效转化生产1,3-丙二醇的特性,将其甘油脱水酶与已知报道的甘油脱水酶（U60992）的序列比对分析,根据差异位点设计了Nβ471的定点突变,利用反向PCR定点突变技术构建了甘油脱水酶（dhaBCE）的突变体质粒M1821,并在E．coli BL21（DE3）中高效表达。SDS—PAGE结果显示,诱导表达后在相对分子质量66、24、16KD出现三条特征条带,与预期结果一致。突变体M1821甘油脱水酶的比酶活为38．7U／mg,催化反应最适pH为8．0,最适温度为40℃,与未突变重组甘油脱水酶比较,最适温度降低了约5℃。     

兔圆小囊组织中抗菌肽类物质的分离纯化及抗菌活性研究

成年健康家兔,经腹腔注射猪大肠杆菌刺激后,取圆小囊组织以捣碎机捣碎,沸水浴处理后,以5％乙酸提取,调整pH值后,经SephadexG100凝胶柱过滤层析,收集各组分并用琼脂糖弥散法检测各组分的抗菌活性,获得纯化的抗菌肽类物质。纯化物经Tricine SDS-PAGE,银染后分析为一条蛋白带,分子量约为7000Da左右,经超滤分析,纯化物的分子量大于3000Da。抗菌肽粗提物和纯化物经体外抗菌实验,对大肠杆菌（078）、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌均表现出较强的抗菌活性。     

扩展青霉FS1884脂肪酶基因的定点诱变及其活性分析

为提高扩展青霉FS1884脂肪酶活性,采用一步突变法对脂肪酶(PEL)的基因进行体外M220V定点诱变,然后将其连接到表达载体pPIC3.5K中, 构建重组表达载体pPIC3.5K-M220V-PEL,电转化毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导后脂肪酶成功分泌表达.重组脂肪酶的活性分析表明:突变体在毕赤酵母中得到活性表达,获得脂肪酶表达产物PEL-M220V-GS,在35 ℃下具有最高酶活为3 099 U/mg, 比野生型提高了5%.     

环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究

本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。