研究聚ADP核糖基化作用与细胞恶变关系的双基因真核表达重…

本文将聚ＡＤＰ核糖聚合酶基因１．４ｋｂ部分序列反向插入真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ和ｐＳＭＧ中，同时１２位密码子突变的活化ｒａｓ癌基因也一同克隆到上述载体中，从而获得具有不同真核基因筛选标记的双基因真核表达重组ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｃｌ．４－Ｔ２４，ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｃｌ．４－ａｒＴ２４，及ｐＳＭＧ－Ｃｌ．４－Ｔ２４，上述质粒的构建成功为研究聚ＡＤＰ核糖基化作用与细胞恶变的关系提供了一种新的分子模型。     

研究聚ADP核糖基化作用与细胞恶变关系的双基因真核表达重组体的构建

本文将聚ADP核糖聚合酶基因1．4kb部分序列反向插入真核表达载体pMAMneo和pSMG中，同时12位密码子突变的活化ras癌基因也一同克隆到上述载体中，从而获得具有不同真核基因筛选标记的双基因真核表达重组体pMAMneo－Cl．4－T24，pMAMneo－Cl.4－arT24，及pSMG－Cl．4-T24，上述质粒的构建成功为研究聚ADP核糖基化作用与细胞恶变的关系提供了一种新的分子模型．     

人核呼吸因子2基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建人核呼吸因子2(NRF2-α和NRF2-β)的真核表达载体,并检测其在瞬时转染的人肝癌BEL-7402细胞株的表达水平。方法:根据NCBI数据库中NRF2-α和NRF2-β的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增目的基因并构建带FLAG标签的真核表达载体,瞬时转染BEL-7402细胞后,分别使用半定量RT-PCR技术和Western blot技术检测其mRNA和蛋白质表达水平。结果:通过酶切鉴定和DNA序列分析,证实已成功构建了人NRF2-α和NRF2-β的真核表达载体,并能在瞬时转染的人肝癌BEL-7402细胞中实现基因的过表达。结论:成功构建了人NRF2-α和NRF2-β的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

两类猪ADP-核糖基化因子的克隆分析与原核表达载体构建

哺乳动物小G结合蛋白——二磷酸腺苷-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,Arfs)除在囊泡运输、细胞骨架重排和调节细胞吞噬等方面起重要作用外,还与病毒的感染有关.前期研究发现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染早期ARFs基因表达明显上调,然而在猪只中ARFs与PRRSV的感染至今知之甚少.本研究中,猪ARF1和ARF4分别被克隆,序列分析发现:ARF1包含一个长度为546bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),预测编码181个氨基酸,理论分子质量为20.70kDa,pI为6.62;ARF4包含一个长度为543bp的开放阅读框,预测编码180个氨基酸,理论分子质量为20.50kDa,pI为5.46.蛋白序列结构分析显示猪ARF1和ARF4蛋白含有典型的p loop,switch区,interswitch区和N端疏水区的Hasp,在第二位都含有可被肉豆蔻酰基化的甘氨酸.猪ARF1和ARF4的原核表达载体也被构建,为进一步研究其在PRRSV感染过程中的调控提供基础.     

斜带石斑鱼干扰素调节因子8基因的鉴定与表达模式分析

干扰素调节因子8(IRF8)是IRF家族转录因子中的一个成员.利用简并PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IRF8基因(EcIRF8)全长cDNA序列,其编码422个氨基酸残基的蛋白质,含有脊椎动物IRF家族的特征性结构域,即N端保守的DNA结合结构域(DBD)和C端多样化的干扰素调控因子结合结构域(IAD),其中DBD中包含5个特征性的色氨酸残基和1个核定位信号.与绝大多数脊椎动物的IRF8基因相似,EcIRF8基因组序列也是9个外显子和8个内含子的结构.EcIRF8在斜带石斑鱼肝脏中高水平表达.活体聚肌胞苷酸刺激后6h,EcIRF8在头肾、中肾、胸腺、肝脏和肠中的表达量显著上调(p0.05),其中在中肾中上调幅度最大,是对照组的106倍;副溶血弧菌(Vibrio paraheamolyticus)刺激后24h,EcIRF8在肝脏中的表达量也显著上调(p0.05),但上调倍数仅为对照组的9.37倍.结果表明,EcIRF8基因可能主要参与斜带石斑鱼的抗病毒免疫反应.     

菠菜转录因子MYB基因家族的鉴定及表达分析

利用生物信息学手段鉴定了76个具有典型R结构的菠菜转录因子(Spinacia oleracea)MYB,其中包括72条R2R3-MYB基因(2R-MYB)和4条R1R2R3-MYB基因(3R-MYB)。通过生物信息学对菠菜MYB转录因子家族成员的理化性质、染色体定位、结构域序列保守性和系统进化关系进行了分析,结果表明:菠菜MYB家族有32个基因位于染色体正链,另外44个基因位于染色体反链;MYB的DNA结合域中的保守域主要位于两个R重复序列的第二和第三螺旋之间,结合域中每个R重复的第一和第二色氨酸之间的氨基酸序列相对不保守;根据菠菜、拟南芥及甜菜的MYB家族系统进化关系可以推测,菠菜MYB家族中56个成员可以按功能划分为4类,在菠菜的生长发育过程中可能起着重要的调节作用,其余成员中有7个MYB基因可能参与菠菜响应氮素浓度的氮素利用及生长发育进程。     

假单胞菌ND6菌株水杨酸羟化酶基因(nahG)的核苷酸序列分析和酶鉴定

水杨酸羟化酶是细菌萘降解途径中的关键酶，它能催化水杨酸脱羟和羟化，生成儿茶酚．假单胞菌(Pseudomonas)DN6菌株的萘降解基因位于102kb的质粒pND6-1上，以pUC18质粒为载体，制备了含有1～3kb pND6-1 DNA随机片段的基因库，通过DNA测序和DNA序列同源性分析，从基因库中筛选出含有水杨酸羟化酶基因nahG的克隆．nahG基因的大小为1305bp，编码的水杨酸羟化酶(NahG)由434个氨基酸组成，与Pseudomonas putida NCIB 9816-4菌株的水杨酸羟化酶基因相比，核苷酸序列的同源性为100％，与其它10种细菌的水杨酸羟化酶基因相比，核苷酸序列的同源性为32％～99％．酶学实验表明，ND6菌株的水杨酸羟化酶具有广泛的底物特异性，它不仅能代谢水杨酸，还能代谢多种水杨酸的衍生物，如乙酰水杨酸、黄基水杨酸、3-甲基水杨酸、5-甲基水杨酸和5-氯水杨酸等．     

一种新细胞因子基因真核表达载体的构建和鉴定

采用PCR方法,以人胎盘cDNA文库为模板,扩增出人B淋巴细胞刺激因子（hBLys）,经克隆测序及纯化后,再以此PCR产物为模板,用Nest-PCR方法进一步扩增得到B淋巴细胞刺激因子的胞膜外功能区域（hsBLyS）的DNA片段,纯化、克隆测定鉴定后,扩增并纯化粒,经酶切、纯化后克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）中,构成真核表达载体pcDNA3．1（＋）／hsBLyS。结果表明：用此方法制备得到的hsBLyS的DNA片段经测序鉴定与文献报道相符,构建的真核表达载体经鉴定也达到了预计的结果。     

DLL1-ICD基因真核表达载体的构建及转染鉴定

通过克隆DLL1-ICD(Delta-like1细胞内区域)的cDNA及测序鉴定,构建pEGFP-C1-DLL-ICD真核表达载体并进行细胞转染,为研究Notch信号通路与Neuritin的关系奠定基础。首先根据小鼠全长DLL1 cDNA序列,设计DLL-ICD PCR引物,以小鼠胎脑cDNA文库为模板,利用PCR技术扩增DLL1-ICD cDNA。将扩增出的基因片段克隆至pEGFP-C1载体,进行DNA序列测定。并进一步将测序正确的pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体转染HEK293细胞。结果显示:成功克隆了DLL1-ICD的cDNA片段,测序结果与基因文库中的DLL1-ICD序列一致,并在转染真核细胞后获得了较好地表达。表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体构建成功,并在293细胞中成功表达了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。研究结果为进一步探讨Notch信号通路与神经系统疾病的分子机制奠定基础。     

钠氢交换调控因子1(NHERF1)的结构与功能

钠氢交换调控因子1是一种由358个氨基酸组成的多功能连接蛋白.其分布位置与表达水平将决定其功能,当其位于细胞膜上,可能表现为一个肿瘤抑制因子;当其处于细胞质中,可能成为致癌蛋白.其功能机制的研究主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和血小板衍生因子(PDGF)、外向整流氯离子通道(ORCC)等信号通路,以及细胞迁移和微丝骨架分布的调控方面.本文对近年来关于NHERF1/EBP50的结构和功能的研究进行了综述.     

脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法,并检测其体外表达目的基因的水平。设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段;应用EcoRI、Bam HI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒,将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Westernblot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。说明成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

副粘病毒Tianjin株F基因真核表达载体的构建及初步鉴定

为研究仙台病毒主要表面抗原f蛋白对小鼠的免疫效果,应用RT-PCR从副粘病毒Tianjin株基因组中扩增出F基因,将其插入pcDNA3的Pcmv下游,构建了F基因真核表达载体,同时使用PCR、限制性酶切和测序等方法对其进行了鉴定,鉴定结果证实构建成功.构建好的F基因真核表达载体可为下一步的体外表达和动物免疫实验奠定基础.     

橡胶树糖代谢调控基因HbF2KP的克隆及表达

根据拟南芥、蓖麻及杨树果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因(F2KP)的核苷酸序列,使用橡胶树胶乳转录组数据库拼接到1条1 228 bp的核苷酸序列,通过两次RACE-PCR获得了橡胶树长2 629 bp的 F2KP基因cDNA序列,命名为HbF2KP。ORF Finder软件分析结果显示,该序列含有211 bp 的5’端非编码区,173 bp的3’端非编码区,以及长度为2 244 bp的开放阅读框(ORF)。氨基酸同源性分析发现,该蛋白含有保守的激酶和酯酶结构域,属于具有双功能的果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶。生物信息学分析显示,HbF2KP蛋白无导肽酶切位点,不具有跨膜结构域且属于亲水蛋白,推测该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,HbF2KP基因在光合组织及非光合组织中均有表达。对非光合库组织胶乳(产胶细胞的细胞质)中的表达模式进行分析,结果显示该基因表达受割胶、伤害处理及死皮胁迫调控,推测其在橡胶树胶乳糖代谢中发挥重要的调控作用,参与橡胶烃的生物合成调控及死皮胁迫应答。此外,HbF2KP表达受部分植物激素或激素类似物如乙烯利(ET)、植物生长素(2,4-D)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)及赤霉素(GA)的调控,但调控作用不明显。     

茶树GELP基因家族的鉴定与表达分析

从拟南芥数据库中获得GELP基因家族注册号,运用生物信息学分析的方法,在茶树数据库中得到了GELP基因家族成员86个,这些基因可分为9个亚族.其编码蛋白的氨基酸数为171～753,理论等电点为4.35～9.48,蛋白质分子量为18.59419～84.55054 kDa.基因结构分析表明,有3条基因只有2个外显子,其余基...     

人色素上皮衍生因子(PEDF)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

实验主要是应用基因重组技术从人胎盘中克隆人的PEDF基因，构建了pBV/PEDF重组质粒，并使之在大肠杆菌中诱导该因子表达成功，这为PEDF蛋白的获取和进一步研究奠定了基础。     

含副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaI基因真核表达重组质粒的构建

用ClaI／EcoRI双切酶切带有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)极鞭毛蛋白FlaI基因的质粒p MD18-FlaI，回收目的基因片段，插和到真核细胞表达载体pIRESneo同样经ClaI/EcoRI切开的窗口中，成功地将FlaI克隆到pIRESneo中，获得有意义的重组质粒pIREneo－FlaI,构建的pIREneo－FlaI真核表达重组质粒，将为海水经济鱼类的副溶血弧菌DNA疫苗的研制奠定基础。     

人表皮生长因子(hEGF)基因的合成、鉴定及植物表达质粒的构建

用PCR方法合成了人表皮生长因子（hEGF）基因，构建了原核表达质粒p 20T-hEGF，研究了原核表达的重组蛋白hEGF的生物学活性，并构建了植物表达质粒，研究表明：无论是融合蛋白GST－hEGF或纯化的hEGF蛋白，都有相当高的生物活性，hEGF蛋白对Hela细胞的增殖有很好的促进作用，免疫小鼠亦能产生很高的免疫应答反应。     

棉花细胞壁蛋白基因分离鉴定与表达分析

棉纤维起源于棉花胚珠外层表皮细胞．研究棉纤维发育,具有重要理论和实践意义．从棉纤维等组织cDNA文库中分离了186个棉花细胞壁结构蛋白基因,按照所编码的蛋白质结构特点,可将这些基因分为三类;富含脯氨酸细胞壁蛋白（Proline—rich cell wall proteins,PRPs）基因、伸展蛋白（Extensins）或者富含羟脯氨酸糖蛋白（Hydroxyproline—rich glycoprotein,HRGP）基因,富含甘氨酸蛋白（Glycine—rich proteins,GRPs）基因．采用cDNA microarray技术,比较上述基因在开花后10天的野生型棉花纤维和无絮无绒（fuzzless—lintless,fl）突变体胚珠表皮中表达谱发现,其中有7个基因在野生型纤维中特异性或高效性表达,表明它们可能与纤维发育有关．     

粗毛栓菌(Trametes gallic)基因启动子的分离与鉴定

粗毛栓菌 (Trametesgallic)总DNA经Sau3AI酶切后插入到启动子探针型载体pSUPV8的BamHI位点 ,在含氨苄青霉素与潮霉素双抗平板上筛选到 8个潮霉素抗性(Hygr)重组子 (命名为 pTP1～ 8) ,其插入片段大小为 0 .5～ 1.7kb ,抗性水平为 0 .15× 10 - 3 ～0 .35× 10 - 3 g/mL .对 pTP6进行酶切分析表明 ,插入片段中含有KpnI ,XbaI和SacI位点各一个 ,用限制酶SacI和XbaI去掉其 5’端 0 .7kb和 1.2kb片段后 ,其潮霉素抗性由 0 .2 5×10 - 3 g/mL均降为 0 .15× 10 - 3 g/mL .将TP5片段与粗毛栓菌总DNA进行Southern杂交 ,结果证明 ,TP5片段来源于粗毛栓菌总DNA .对片段TP5的 3’端进行序列分析 ,发现它存在真核生物和原核生物基因启动子的保守序列     

我的巴西缘(上)

30年弹指一挥间。世界变化之大,中国变化之大,中国与巴西关系变化之大,令人思绪万千。整个60年代,我国在30多个拉美国家中只有一个建交国——古巴。进入70年代,智利成了同我国建交的第二个拉美国家。中美关系打开后,拉美各国争先恐后地同中国发展关系。现在,与中国建交的拉美国家,无论从地理面积或是人口上计算,都占拉美国家总和的90%多。30