两重巢式PCR检测母体外周血中胎儿游离DNA

使用两重巢式PCR技术检测母体外周血中胎儿游离DNA,为非损伤性产前鉴定胎儿性别和诊断单基因疾病奠定基础.采用改良的chelex100方法提取60例孕龄为16~36周孕妇的外周血浆中游离胎儿DNA,依据NCBIX染色体长臂ATL1位点,Y染色体上DYS14位点序列,设计并合成引物,用巢式PCR同时扩增2个基因片段,以鉴定胎儿性别.结果表明:有ATL1位点和DYS14位点的扩增产物261bp和198bp鉴定为男性胎儿,而仅有261bp扩增产物鉴定为女性胎儿.均以真实出生性别进行确认后发现,此方法能有效提高检测特异性.两重巢式PCR能够简便并准确地鉴定胎儿性别,对单基因疾病特别是X-连锁遗传病的诊断有积极意义.     

利用SRY基因鉴定绵羊成纤维细胞性别的研究

SRY是哺乳动物性别决定的重要基因，利用绵羊SRY基因序列设计PCR引物，对绵羊胚胎来源的成纤维细胞提取总DNA进行PCR扩增，鉴定6个不同胚胎来源的成纤维细胞的性别．结果表明，3个有扩增带为雄性，3个无扩增带为雌性，为核移植选取雄性或雌性转基因成纤维细胞提供一项可行的方法．同时提取牛、山羊、小鼠的总DNA，利用绵羊SRY基因引物进行扩增，对SRY基因在哺乳动物中的保守性进行研究．结果表明，绵羊SRY基因保守区外的一对引物对雄性山羊、绵羊、牛及小鼠均能扩增出特异的DNA片段，说明SRY基因序列有很强的保守性．     

SRY基因在部分动物类群系统进化中保守性研究

用特异于人 HMG- box区域的一对引物 ,对脊推动物 5个纲 10个物种及 2种无脊推动物的基因组 DNA进行 PCR扩增 ,并以 dig标记的人 SRY基因为探针 ,与扩增产物进行 Southern杂交 ,结果表明 :在这 12个物种中都存在 SRY基因的同源序列 ,无脊推动物克氏螯虾及背角无齿蚌杂交中显色较慢 ,表明 SRY基因在系统进化中具有高度的保守性且同源程度与物种在进化上的地位有关     

鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

利用妊娠奶牛血液快速鉴定不同发育阶段的胚胎性别

采集妊娠奶牛静脉血液，从血浆中提取胎儿DNA，利用牛Y染色体上性别决定基因（sex-determining region Ylinked gene, SRY gene）的特异性序列设计引物，应用巢式PCR扩增SRY基因特异性片段，同时以牛肌动蛋白（β-Actin）特异性片段的扩增产物作为内参照，对32头妊娠奶牛早期胚胎性别进行鉴定。结果表明：从不同妊娠期奶牛血浆中提取胎儿游离DNA进行胚胎性别鉴定的总准确率为80％，其中1～2月龄、2～3月龄、4～8月龄胚胎性别鉴定的准确率分别为60％、85．7％、92．3％。     

虎纹蛙Sox基因的PCR扩增及SSCP分析

本文采用PCR技术,以特异扩增人SRY基因HMG－box保守区的一对引物,扩增了虎纹 蛙Sox基因（SRY－box gene）。并对扩增产物进行了SSCP分析。结果雌雄虎纹蛙个体均扩增 出一条带,大小为221 bp,表明虎纹蛙Sox基因在雌雄个性间无性别特异性。SSCP分析结果 显示虎纹蛙Sox基因雌雄个体片段的单链迁移率无差异,而与人的有较大差异。本文为探讨 虎纹蛙的性别决定机制及Sox基因的进行提供了分子资料。     

黑斑蛙Sox基因的PCR扩增

以特异扩增人SRY基因HMG -box保守区的一对引物 ,扩增了黑斑蛙的Sox基因 (SRY -boxgene) .结果表明 ,雌雄黑斑蛙个体均扩增出了两条带 ,大小分别为 4 50bp和 90 0bp ,显示了Sox基因在黑斑蛙雌雄个体间无性别特异性 ,且可能含有内含子 .本文为探讨黑斑蛙的性别决定机制及Sox基因的进化提供了分子资料 .     

PCR技术在动植物检疫中的应用

一、PCR技术基本原理多聚酶链式反应,英文缩写为PCR,又称无细胞分子克隆法,是近年发展起来的一种快速的特定DNA片段体外扩增法,即一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法.PCR利用两个寡聚核苷酸杂交对应链目的区域的侧翼上,一连串反应包括模板变性作用、引物退火和由DNA聚合酶酶促退火、引物延伸的周期性重复产生特定片段的指数积聚.该片段的末端由引物的5′末端决定.因为一个周期所合成的引物延伸产物可作为下一个周期的模板,所以靶DNA拷贝数目在每个周期中近似地呈倍数增加.这样,20个PCR周期可得约百万(2~(20))倍扩增.把扩增产物放进电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼能看见扩增特异区段的DNA带.     

赤麂Sry基因的定位及Y染色体的鉴别

应用流式细胞仪分离赤麂的1,Y1,Y2染色体,通过简并寡核苷酸引物聚合酶链式反应(DOP-PCR)增加模板数量.用人的性别决定基因HMG框内设计1对引物进行PCR扩增.在雄性赤麂Y2染色体DOP-PCR产物中扩增出与人SRY基因同源的Sry基因片段,经克隆测序后,初步证明赤麂Y2染色体是真正的Y染色体,同时对赤麂Sry基因进行了初步定位.     

错配PCR对牛X染色体相关基因杂合子的检测

利用DNA测序技术,在荷斯坦奶牛胎儿中找到X染色体基因GLRA2 3'端的杂合位点(C/T),设计错配引物在该位点对胎儿及其父本、母本基因组进行PCR扩增,建立起GLRA2基因的错配PCR技术,该技术可以快速在群体基因组中检测这一杂合位点.     

黄鳝性别决定与SRY基因不相关

以人和鼠的SRY片断为探针与黄鳝基因组DNA进行杂交,发现雌雄黄鳝中均有相同的杂交带.用一对SRY基因保守区HMGbox的引物,在雌雄黄鳝的基因组DNA中均扩增出约200bp片段.将此片断克隆测序后发现雌雄个体中此片断仅相差1个bp,且与人的SRY基因HMG盒基因极相似.以该片段与雌雄个体的RNA进行Northern杂交未能检测到杂交带,RT-PCR反应扩增出一条微弱的200bp片段.以上结果表明:在雌雄黄鳝的基因组DNA中均存在SRY同源片断;黄鳝中的SRY同源片断可能与其性别无直接关系,而是具备其他功能,由此推测低等脊椎动物的性别决定可能由其他基因控制.     

改进的PCR法克隆带小棒链霉菌cefD基因

以GC含量高达74％的带小棒链霉素（S．clavuligerus）染色体DNA为模板，从引物设计、退火温度、有机辅剂及DNA聚合酶等方面改善PCR反应体系和扩增条件，成功地克隆得到了异青霉素异构酶的cefD基因。改进后的PCR体系中ψDMSO＝0．05并加入适量的TaqDNA聚合酶，退火温度比常规选选择高一些，从而克服了常规PCR法扩增链霉菌基因遇到的二级结构复杂、引物与模板难以配对及引物间的引物内部易形成碱基配对等问题。改进后的PCR法提高了链霉菌基因克隆的效率，也可以广泛应用于高GC含量目的的基因的快速扩增。     

PCR用于孕牛外周血中胎儿SRY序列检测和奶牛早期胚胎性别鉴定

根据文献报道的人，鼠，兔ＳＲＹ同源序列设计引物，从牛基因组中扩增出一段牛特异的ＳＲＹ序列，对该序列进行克隆测序后设计出一对雄牛特异的ＰＣＲ引物，利用此引物对奶牛早期胚胎细胞和妊娠晚期母牛外周血ＤＮＡ样品进行ＰＣＲ扩增，经分娩牛犊性别验证，本引物能够准确鉴别孕牛外周血中雄性胎儿的ＳＲＹ序列，并且对早期胚胎性别签定的准确率为８０％．     

PCR用于孕牛外周血中胎儿SRY序列检测和奶牛早期胚…

根据文献报道的人、鼠，兔ＳＲＹ同源序列设计引物，从 在因组中扩增出一段牛特异的ＳＲＹ序列，对该序列进行克隆测序后高度出一对雄牛特异的ＰＣＲ引物，利用此引物对奶牛早期胚胎细胞和妊娠晚期母牛外周血ＤＮＡ样品进行ＰＣＲ扩增，经分娩牛犊性别验证，本引物能够准确鉴别孕牛外周血中雄性胎儿的ＳＲＹ序列，并且对早期胚胎性别鉴定的准确率８０％。     

塔里木马鹿胎儿性别鉴定

为建立一种简单、准确的塔里木马鹿早期胎儿性别鉴定新方法,本研究利用妊娠马鹿血浆中胎儿游离的DNA为模板,通过常规PCR扩增牙釉蛋白特异序列,对89头妊娠12-14周龄塔里木马鹿进行胎儿性别鉴定,鉴定结果与实际产犊性别进行比较。结果表明:成功从X染色体上扩增出282 bp的片段,从Y染色体上扩增出252 bp的特异性片段;89头妊娠母鹿胎儿检测结果显示,50头为公,39头为母,与实际产仔性别比对后,鉴定准确率为91.01%。由此可知,利用胎儿游离DNA和牙釉蛋白基因对塔里木马鹿进行早期胎儿性别鉴定,方法简单且准确率高。     

茄子反转录转座子基因片段的克隆及序列分析

根据己报道的反转录转座子的序列设计合成一对特异引物,以西安绿茄基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法扩出一条DNA特异片段并克隆到pMD18-T载体中.用PCR法和酶切分析法对克隆片段进行鉴定并进一步进行核苷酸序列分析.序列测定该片段长为518 bp.用GenBank中的BLAST程序分析表明,该片段与马铃薯(Solanum demissum)反转录转座子的gag-pol聚合蛋白90-243aa区域氨基酸同源性为43%.     

PCR-RFLP技术应用于鉴定美洲斑潜蝇和番茄斑潜蝇的初步研究

本文试探运用 PCR- RFL P技术 ,从美洲斑潜蝇 (L iriomyza sativae)和番茄斑潜蝇 (L iriomyza bryoni-ae)中提取总的 DNA,根据实蝇 18S和 5 .8S保守序列设计一对引物扩增这两种斑潜蝇的 ITS1基因区域 ,用五种限制性内切酶对 PCR产物进行酶切 ,构建了酶切图谱。从酶切图谱中选择特异酶切位点作为区分两种斑潜蝇的标记。根据特异的酶切片段来区分这两种斑潜蝇     

中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR方法的建立和优化

根据GenBank中卤虫actin基因的保守区域序列设计井合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ作为染料建立了实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quanfitative PCR）方法．以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,其相关系数达到了0．999．溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰,Tm为83.6℃,结果表明：本实验建立的中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR法扩增效率高、特异性强、线性范围广、检测周期短,为actin基因作为内参基因进行卤虫早期胚胎发育基因表达的定量分析奠定了基础．     

杉木单染色体扩增产物的RAPD分析

在显微操作器上微分离杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook)的4条单染色体，以简并寡核苷酸为引物进行PCR扩增(DOP—PCR)，并将其DOP—PCR产物进行RAPD分析。结果表明，不同染色体扩增产物间有明显多态性；用RAPD-PCR的方式可反应出不同染色体遗传信息的差异，从这些差异中可能找到属于某单染色体的特异信息，进而在分子水平上对染色体进行编号。     

扬子鳄Sox基因的PCR-SSCP分析

参照人SRY基因HMG－box保守区的序列,设计一对引物,扩增了扬子鳄的Sox基因,并进行了SSCP分析,结果显示扬子鳄Sox基因的扩增片段与人SRY基因扩增片断大小相同,为220bp左右;且雌雄个体间该基因片段的单链迁移率无差异,而与人的有较大差异,本研究为扬子鳄的性别决定机制的探讨及Sox基因的进化保守性分析提供分子资料。