重组毕赤酵母植酸酶N-糖基化位点质谱鉴定

为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础.     

真菌嵌合体植酸酶的构建及其抗蛋白酶水解特性研究

 在烟曲霉植酸酶（Afp）的基因上,通过PCR逐步将编码1-47、178-237及338-381多肽序列的DNA片段置换为黑曲霉NRRL 3135植酸酶（Anp）中的对应片段,构建了3个嵌合体（嵌合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因,并在毕赤酵母中将其成功表达及纯化。所有的嵌合体和亲本植酸酶均能抵抗胃蛋白酶。在m(胰蛋白酶)/m(植酸酶)为0.1时,Anp完全失活;但Afp与所有嵌合体的活性仅损失13%~23%。胰蛋白酶水解产物的SDS-PAGE结果显示嵌合体Ⅱ与Ⅲ也能被胰蛋白酶严重水解,但非变性PAGE结果却表明它们在水解后仍能保持结构完整。嵌合体也具有一些与Anp及Afp相异的新pH曲线及耐热性。实验表明,通过替换基因片段改良真菌植酸酶可行。     

毕赤酵母表达重组植酸酶酶学性质的比较研究

通过酶学性质比较毕赤酵母GS115表达的E.coli K12植酸酶(appA)及其突变体植酸酶(appA NR)和黑曲霉植酸酶(phyA)的最适pH、温度、热稳定性及对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性.结果表明,在95℃,加热10 min,appA NR可残余90％左右的活力,而其他两种只残余20％～50％的活力;appAN...     

烟曲霉脂肪酶B在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

从烟曲霉Aspergillus fumigatus GIM3.20中克隆获得了一种脂肪酶B基因(AFLB)。通过序列比对,发现AFLB与南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的氨基酸序列有31%的一致性,两者同属CALB家族脂肪酶；AFLB 含有与家族其他成员类似的保守五肽序列(SWSQG),预测AFLB的催化三联体分别为S233、D318和H361,其中Ser233位于保守五肽序列中；此外AFLB含有一段N-端延长序列(由第1~128位氨基酸组成),是曲霉属脂肪B的特有序列。在毕赤酵母中成功地异源表达了脂肪酶AFLB,并通过亲和层析进行了纯化。SDS电泳结果显示,该酶存在部分高度N-糖基化和部分无糖基化的两种形态,对应分子量分别为45~66kDa和42kDa。酶学性质表征结果显示,重组脂肪酶AFLB最适反应pH 值为7.0,最适反应温度为40℃,并在50℃以下具有较好稳定性,其最适底物为肉豆蔻酸对硝基苯酯。脂肪酶AFLB与CALB有高度亲缘性,具有潜在的工业应用前景。     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

植酸酶基因在毕赤酵母中表达及表达酶性质研究

PCR扩增无花果曲霉 As3 .3 2 4的植酸酶基因 phy A ,测序分析表明 ,phy A 全长1 5 1 5 bp,其中 1 1 1个核苷酸为内含子序列 ,共编码 467个氨基酸 ,N端的 1 9个氨基酸为信号肽 ,序列中存在 1 0个潜在的 N-糖基化位点 .构建 phy A 的酵母转化载体 p PIC9K/phy A ,电击法转化毕赤酵母 GS1 1 5 ,获得植酸酶基因重组酵母菌 GS1 1 5 /phy A .其发酵酶活性比 As3 .3 2 4提高了 3 3倍 .GS1 1 5 /phy A 植酸酶作用 p H有两个峰值 ,分别为 2 .5和4.5 ,最适作用温度为 60℃ .与 As3 .3 2 4相比 ,重组毕赤酵母 GS1 1 5 /phy A 植酸酶的热稳定性有显著提高 .     

植酸酶基因在毕赤酶母中表达及表达酶性质研究

PCR扩增无花果曲霉As3.324的植酸酶基因phyA I，测序分析表明，phyA I全长1515bp,其中111个核苷酸为内含子序列，共编码467个氨基酸，N墙的19个氨基酸为信号肽，序列中存在10个潜在的N-糖基化位点，构建phyA I的酶母转化载体pPIC9K/phyA Ⅱ，电击法转化毕赤酶母GS115，获得植物酶基因重组酶母菌GS115/phyA Ⅱ，其发酵酶活性比As3.324提高了33倍，GS115/phyA Ⅱ植酸酶作用pH有两个峰值，分别为2.5和4.5，最适作用温度为60℃，与As3.324相比，重组毕赤酶母GS115/phyA Ⅱ植酸酶的热稳定性有显著提高。     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子,采用基因半合成技术合成人胰岛素基因.将合成的胰岛素基因克隆到pP IK 9质粒,构建了毕赤(P ich ia)酵母重组表达载体pP IN S319,用B g lⅡ线性化后用电转化法导入毕赤酵母G S ll5菌株,经过营养筛选和PCR复筛,得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株.经SDS-PAGR和密度扫描分析表明,合成的人胰岛素基因能够在毕赤酵母中高效分泌性表达,表达量可达0.563 m g/mL,表达产物无需转肽过程,只经过胰蛋白酶和羧肽酶B简单处理即得到优质重组人胰岛素,其体内活力约为30 IU/m g.     

HIV-1外膜蛋白gp120在酵母Pichia pastoris中的表达

目的 用巴斯德毕赤酵母系统表达HIV外膜糖蛋白gp120.方法 将从HIV-1型国际标准株pHXB2-gp160的基因序列中扩增出的gp 120分子的长片段基因(1 419 bp)和短片段基因(417bp)分别克隆入真核表达载体pPICZαA与pPICZB中,以电穿孔法转化酵母GS 115.用YPDS-zeo平板筛选重组子、PCR方法检测整合到酵母菌GS 115基因组中的gp 120片段基因,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.结果 诱导后gp 120短片段多肽在GS 115中少量表达,在诱导表达24 h重组蛋白表达量及抗原性达到最高,表达产物被降解,具有良好的抗原特异性.诱导后gp 120长片段多肽未被GS 115所表达.结论 在巴斯德毕赤酵母中成功表达gp 120分子长片段需要优化gp 120基因,为制备HIV-1的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础.     

液质联用研究人重组干细胞因子一级结构

通过高效液相色谱(HPLC)和质谱技术,对人重组干细胞因子(rhSCF)分子进行分析,以确证其一级结构.将rh-SCF样品胰酶酶切,HPLC-RPC分离,基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF-MS)对rhSCF的酶切肽段进行解析,并对rhSCF的O-糖基化和N-糖基化位点进行了分析.结果:(1)rhSCF分子质量得到测定;(2)rhSCF的一级结构得到确认,测定的肽质量谱的覆盖率达到94%,分子中有两对二硫键;(3)鉴定了样品中的N-糖基化位点,并对rhSCF产品的O-及N-连接糖型上的糖结构进行初步探讨.结果显示:rhSCF一级氨基酸序列和二硫键形成位置与理论上一致,糖基化特性符合毕赤酵母表达蛋白的糖基化特点.     

葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...     

毕赤酵母YPS1基因的失活对减少重组人血清白蛋白降解的作用

重组人血清白蛋白在毕赤酵母系统的分泌表达产物除了完整的重组人血清白蛋白外,还存在一约45 ku大小的主要降解片段,直接影响了重组人血清白蛋白的产量和后续的纯化研究.为了减少重组人血清白蛋白的降解,采用同源重组的方法,使毕赤酵母中蛋白酶基因YPS1失活,构建获得蛋白酶缺陷型菌株,研究YPS1基因失活后对重组人血清白蛋白降解的影响.结果表明,毕赤酵母YPS1基因的失活有效地减少了重组人血清白蛋白的降解,完整的重组人血清白蛋白在总蛋白中的比例由原来的60%提高到88%,降解片段由原先的40%降低到10%左右.     

两种葡萄糖氧化酶基因分别在酿酒酵母及毕赤酵母中的重组表达

从Aspergillus niger CICC 40179中克隆得到了葡萄糖氧化酶(GOD)基因,并在酿酒酵母AS2.489中通过载体p2μRCMB进行重组表达.合成来源于A.niger的一段GOD基因(美国专利号为5094951),同时对其进行了少量密码子的同义替换以避免部分酶切位点,将该段合成的序列通过甲醇诱导型载体p PICZαA在毕赤酵母X33中进行了重组表达.比较分析两种葡萄糖氧化酶的分泌表达情况.     

重组人源性抗HBsAg Fab抗体的特性分析

通过噬菌体展示技术从含高滴度抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的人外周血淋巴细胞获得抗HBsAg Fab抗体的轻、重链基因．将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母(Pichua pastons)GS115菌株的染色体上，成功构建了高效分泌表达抗HBsAg Fab抗体的酵母工程菌．对酵母表达的重组Fab抗体进行了纯化，并对其相对分子质量、糖基化以及抗原结合能力等特性进行了分析，结果显示重组酵母分泌表达的重组人源性抗HBsAg Fab是一个相对分子质量为50000左右的低糖基化糖蛋白，1mg重组Fab抗体相当于40u的抗乙肝表面抗原抗体(20U／mg)．表明重组Fab抗体具有较强的结合HBsAg的能力．     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticalipase B,CALB)的表达量,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子(10 mmol/L)Ca2+,Zn2+,Mn2+有助于CALB酶活力的提高,而Cu2+,Ag+,Fe3+强烈抑制酶催化反应.     

嗜碱芽孢杆菌耐热耐碱内切木聚糖酶基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达

【目的】研究极端耐热耐碱的木聚糖酶,使其能够满足造纸行业中碱性高温的苛刻环境。【方法】将一种来源于嗜碱芽孢杆菌S7的耐热耐碱内切木聚糖酶基因(xyn10A)密码子进行优化,基因合成后克隆至pHBM905BDM载体上,并转化毕赤酵母GS115菌株。【结果】木聚糖酶基因(xyn10A)优化后与原始序列比对相似性为76.70%。基因合成后克隆到pHBM905BDM载体上,并成功转化毕赤酵母GS115菌株。通过交联木聚糖底物平板水解圈法初筛及摇瓶复筛得到一株产酶量较高的菌株,且其在摇瓶发酵第10天达到最高酶活力,为495U/mL。另外,糖基化分析表明该酶在毕赤酵母中表达时被糖基化修饰。【结论】密码子优化后的极端耐热耐碱木聚糖酶基因在毕赤酵母中成功表达。     

克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.