RNAi表达载体在哺乳动物中的研究进展

对RNA干扰(RNAi)表达载体的非生物与生物递送系统及主流应用进行综述,明确其在基因调控及未来基因治疗领域的应用前景,并指出其在种属特异性及表达效率等方面存在的局限性.对RNAi表达载体的结构组成、发展沿革及体内作用机制进行归纳分析,提出基于结构组成和加工机制双重属性的分类方法.     

Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化

文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘（Citus reticulate）的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR. 通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株. 这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持.     

甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体pFGC5941-BnBRI1和RNA干扰载体pFGC5941-BnBRI1-Ri,以根癌农杆菌介导的方法转化甘蓝型油菜"W679"下胚轴外植体,经PCR鉴定,获得18株转基因阳性植株,其中1株为BnBRI1基因过量表达转基因植株,17株为BnBRI1基因RNA干扰转基因植株.经RT-PCR鉴定显示,在过表达转基因植株中BnBRI1基因表达量比野生型甘蓝型油菜高,而在RNA干扰转基因植株中表达量比野生型低,RNA干扰BnBRI1基因的表达导致了植株的矮化,矮化植株将可用于油菜株型的遗传改良,以培育适于机械化生产的中矮秆油菜新品种.     

“中花11”水稻谷蛋白Gt1基因克隆及蜡质基因启动子引导Gt1基因表达载体的构建

谷蛋白含量及分布对水稻营养品质起着至关重要的作用．利用PCR技术从“中花11”水稻基因组成功克隆到谷蛋白Gt1基因,再分别以PCR技术和限制酶酶切从p13W。载体上获得水稻蜡质基因（Waxy）启动子、第一内含子和NOS终止子,并以pCAMBIA1301双元载体为骨架,成功构建了由Waxy启动子引导的水稻Gt1基因表达载体,为今后利用转基因技术改良水稻稻米营养品质奠定了基础．     

拟南芥HIS1-3基因克隆及表达载体构建

文章提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR扩增出HIS1-3基因的cDNA片段,连接到pEASY-T1Simple载体上,转化到Trans1-T1感受态细胞内,筛选阳性单克隆并抽提质粒。利用限制性内切酶Eco91Ⅰ和NcoⅠ对质粒pEASY-T1-HIS1-3和植物表达载体pCAMBIA2301进行完全双酶切,通过电转化法,将重组表达载体pCAMBIA2301-HIS1-3导入根癌农杆菌C58中以期获得携带HIS1-3基因的根瘤农杆菌株,为研究HIS1-3基因的抗逆分子机理以及遗传改良作物抗逆性奠定了基础。     

水稻OsRhoGDI2基因RNA干扰载体的构建

水稻OsRhoGDI2是通过酵母双杂交筛选到的小G蛋白Rho家族成员OsRacD互作蛋白的编码基因,为了研究OsRhoGDI2与OsRacD的相互作用及其在水稻发育中的功能联系,本研究基于序列比对的提示,选择了OsRhoGDI2基因长度为285 bp的特异区段,分别以正向和反向插入中间载体pKANNIBAL中,并亚克隆...     

水稻精细胞基因RSSG58启动子的克隆分析及表达载体构建

根据分布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列，以水稻品种“桂朝2号”黄化苗组DNA为模板，用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58，经过Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植物启动子的保守元件，预计它的RSSG58基因在特异表达方面具有一定的作用。为了鉴定RSSG58基因的基本启动子元件，将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析，由PCR从Pr58中得以3个不同大小两端带有HindⅢ，BamHⅠ酶切位点的片段Pr58Ⅰ，Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP）中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报造基因GFP的植物表达载体pRGFPⅠ，pRGFPⅡ和pRGFPⅢ，用于农杆菌介导法水稻遗传转化。其目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础。     

中性蛋白酶基因的克隆与表达载体的构建

中性蛋白酶是指其最适作用pH为6－7．5的一类蛋白酶，其主要作用为皮革脱毛、毛皮软化、制蛋白胨、 酵母膏、肝宁及用于食品工业等。我们从枯草杆菌中克隆出中性蛋白酶基因，并成功构建了中性蛋白酶基因表达载体，为下一步实现蛋白酶的高效表达奠定了基础。     

OsICK1基因植物反义表达载体的构建及遗传转化

OsICK1是水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因．我们构建了水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因（OsICK1）的植物反义表达载体，在农杆菌的介导下尝试使antisense OsICK1整合到水稻基因组中并初步得到验证．为进一步研究OsICK1对水稻细胞周期调控的作用奠定了基础．     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.     

小麦AGPase胞质型小亚基SSU I的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基(AGPase plastic small subunit,SSU I)的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSU I的cDNA全长为1465 bp(GenBank No.EF405961),编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1423 bp.同源性比较结果表明:与GenBank上已报道的SSU I基因(X66080,AF244997,Z48562)同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSU I基因的过表达载体p.WM101SSU I S;将该基因反向置于pB1121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU I的反义表达载体pBI121SSU I A.同时还克隆出SSU I基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU I.     

水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板利用PCR技术克隆出了对应的5′侧翼序列.经过测序分析,该序列具有许多启动子特征的顺式作用元件,加TA-box,CpG岛等.将这些启动子序列连接到pCAMBIA1391Z双元载体中,构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测.     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

水稻转座子Pong特异性RNAi载体TPAS的构建和农杆菌介导的遗传转化条件的优化

为研究水稻转座子Pong的功能,构建了Pong的特异RNAi表达载体TPAS,并利用农杆菌介导法将这个载体转化到水稻的成熟胚愈伤组织,获得了PCR阳性的再生植株.同时通过对农杆菌侵染途径、侵染浓度和侵染时间等的研究,建立并优化了水稻的遗传转化程序,结果表明:在农杆菌侵染成熟胚愈伤组织的时间为3 min,共培养2～4 d...     

水稻petH基因启动子的克隆及其转化载体的构建

以水稻幼嫩叶片为材料,提取基因组DNA;根据GenBank公布的该启动子序列设计引物,克隆了水稻的petH启动子,并构建了用于植物转化的双元载体p1391Z-OsR-petH-pro,为进一步研究该启动子在植物体中表达调控模式提供了试验条件。     

人乳铁蛋白基因克隆及表达载体构建

通过ＰＣＲ法扩增出２３６６bp的人乳铁蛋白cDNA、８００bp的山羊β－乳球蛋白基因５′端调控序列,经ＰＣＲ反应连接后,克隆到表达载体pLNCX中,测序结果表明,与ＧeneBank中登录的序列相比,所获人乳铁蛋白cDNA序列的同源性为９９．７４％,山头β－乳球蛋白基因５′端调控序列的同源性为９９．７５％。酶切结果证明得到了正确的重组载体,可用于乳腺生物反应器的研究。利用ＰＣＲ反应直接克隆目的片段,并通过同源序列进行ＰＣＲ连接,极大提高了克隆的速度和准确性,,为基因克隆及其表达研究带来了方便。     

水稻转座子Pong RNAi载体的构建和农杆菌介导的遗传转化

为探讨水稻转座子Pong的功能及其对水稻基因组甲基化的影响,构建了水稻转座子Pong的RNAi表达载体TPAI和TPAⅡ,并利用这两个载体采用农杆菌介导法转化水稻(品种松前)的成熟胚愈伤组织,获得PCR结果阳性的再生植株.同时通过不同的农杆菌侵染途径、侵染浓度和侵染时间等,建立并优化了水稻的遗传转化程序.结果表明:农杆...