菊粉内切酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质测定

为了实现菊粉内切酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高活性表达并对表达的菊粉内切酶酶学性质、水解菊粉的产物进行分析。通过下载无花果曲霉菊粉内切酶基因的编码序列,做了密码子优化后进行全基因合成,然后在毕赤酵母GS115中表达。对表达的菊粉内切酶的酶活、最适反应温度、最适pH值、热稳定性进行了分析,最后对酶水解菊粉的产物进行了高效液相色谱(HPLC)分析。摇瓶表达的酶活力为420 U/mL,酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为6.0。HPLC分析表明:表达的菊粉内切酶酶解底物菊粉的主要产物为低聚果糖,聚合度为3～5之间。构建的工程酵母可以高效表达菊粉内切酶,可以用于生产低聚果糖。     

克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.     

信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种新型的非常规酵母,具有生长快、分泌能力强、安全性高等优势.在酵母表达系统中,分泌信号肽不仅介导了外源蛋白沿着正确途径分泌到胞外,也在蛋白质翻译后加工等方面发挥了重要作用.本文分别研究了酿酒酵母α-Factor信号肽和克鲁维酵母菊粉酶信号肽对耐热木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达影响.工程菌摇瓶发酵72h后,在含有菊粉酶信号肽和α-Factor信号肽的工程菌株的发酵上清中,木聚糖酶酶活分别为318.91U/mL和117.90U/mL,表明马克斯克鲁维酵母表达木聚糖酶时,菊粉酶信号肽介导的蛋白分泌表达效果优于α-Factor信号肽.重组表达木聚糖酶最适反应条件是pH5.5和65℃,在75℃处理1h后,该酶的剩余酶活保留73%以上.在5L发酵罐中,重组菌高密度发酵72h,木聚糖酶酶活高达157 757U/mL,结果表明,马克斯克鲁维酵母表达系统在工业酶领域中应用具有非常广阔的前景.     

GH43家族β-D-木糖苷酶RuXyn1在马克斯克鲁维酵母中的表达及其应用

木聚糖的降解需要内切β-木聚糖酶和β-D-木糖苷酶的协同作用,β-D-木糖苷酶能将β-木聚糖酶的水解产物木寡糖降解为木糖,因此在半纤维素的利用中具有重要的意义.本研究将中国牦牛瘤胃微生物来源的糖基水解酶GH43家族β-D-木糖苷酶基因RuXyn1克隆到含两种不同分泌信号肽(菊粉酶信号肽和α-factor信号肽)的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)分泌表达载体(pUKDN132和pUKDN129)中,转化K.marxianus Fim-1 ura3Δ,通过筛选获得两株分泌表达β-D-木糖苷酶基因RuXyn1的重组菌株Fim-1/pUKDN132-RuXyn1和Fim-1/pUKDN129-RuXyn1.重组菌株摇瓶培养72h后,上清液中β-D-木糖苷酶酶活分别为0.304U/mL和0.045U/mL.在5L发酵罐高密度发酵中,Fim-1/pUKDN132-RuXyn1分泌表达的β-D-木糖苷酶酶活为1.75U/mL,而Fim-1/pUKDN129-RuXyn1的酶活为1.6U/mL,表明在表达β-D-木糖苷酶RuXyn1时,菊粉酶信号肽介导的分泌效率优于α...     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

α-1,6-葡聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

根据朱黄青霉(Penicillium minioluteumHI-4)α-1,6-葡聚糖酶的基因序列,人工合成α-1,6-葡聚糖酶基因并将其插入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA,PCR和双酶切验证结果均表明成功构建了重组质粒pPICZαA-Dex.重组质粒经SacⅠ线性化后整合到毕赤酵母X33基因组中进行表达.摇瓶发酵表明,重组毕赤酵母经甲醇诱导120 h产酶活力达到最高值29.2 U/mL,SDS-PAGE结果显示在67 ku附近有明显的条带,与α-1,6-葡聚糖酶理论分子质量相符合.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA(含pAOX1启动子)和pGAPZαA(含pGAP启动子)中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96h后,CLAB活力达到11.1U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2U/mL,蛋白质量浓度为1.36mg/mL.体积分数12%SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5~9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5%.5mmol/LMg2+、Ni+、Co2+和体积分数0.10%SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2+强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05%TritonX-100对CALB稍有激活作用.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticalipase B,CALB)的表达量,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子(10 mmol/L)Ca2+,Zn2+,Mn2+有助于CALB酶活力的提高,而Cu2+,Ag+,Fe3+强烈抑制酶催化反应.     

嗜碱芽孢杆菌耐热耐碱内切木聚糖酶基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达

【目的】研究极端耐热耐碱的木聚糖酶,使其能够满足造纸行业中碱性高温的苛刻环境。【方法】将一种来源于嗜碱芽孢杆菌S7的耐热耐碱内切木聚糖酶基因(xyn10A)密码子进行优化,基因合成后克隆至pHBM905BDM载体上,并转化毕赤酵母GS115菌株。【结果】木聚糖酶基因(xyn10A)优化后与原始序列比对相似性为76.70%。基因合成后克隆到pHBM905BDM载体上,并成功转化毕赤酵母GS115菌株。通过交联木聚糖底物平板水解圈法初筛及摇瓶复筛得到一株产酶量较高的菌株,且其在摇瓶发酵第10天达到最高酶活力,为495U/mL。另外,糖基化分析表明该酶在毕赤酵母中表达时被糖基化修饰。【结论】密码子优化后的极端耐热耐碱木聚糖酶基因在毕赤酵母中成功表达。     

菊粉酶高活力菌株的筛选和发酵条件的研究

从101林酵母中筛选出一株高菊粉酶活力的菌株克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)y-85,该菌株菊粉酶的合成受木糖或菊粉的诱导,产酶适宜的培养基组成(％)为:菊芋抽提液7.0,尿素2.0,玉米浆3.0,产酶的最适温度和pH分别为30℃和5～6,在这些条件下,摇瓶培养24h,该菌株产生的酶活力可达1403u/ml。     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

Expression of Aspergillus niger 9891 Endoinulinase in Pichia pastoris

An endoinulinase gene from Aspergillus niger 9891 (CGMCC0991) has been expressed in Pichia pastoris GS115 using pPIC9 vector. The recombinant endoinulinase was highly expressed and the optimization of the expression in a 7 liter of fermentor has been investigated. In fermented broth, the concentration of protein secreted is 2.15 mg/ml. The activity of endoinulinase is 1501 U/ml with sucrose as substrate and 291 U/ml with inulin as substrate, 105 and 273 times higher than that from the original strain respectively.     

不同比生长速率对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响

不同比生长速率控制条件下毕赤酵母代谢流流向不同,从而导致产酶量的不同。为了得到毕赤酵母发酵生产植酸酶的最适比生长速率,对毕赤酵母工程菌50 L发酵生产植酸酶的工艺条件进行了研究。结果表明,通过调节甲醇的流加速度,控制菌体比生长速率为0.02 h^-1,发酵结束时,植酸酶酶活17 445 U/mL,比对照提高69.7 %,该比生长速率对发酵生产植酸酶最有利。     

不同湿重诱导对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响

为了提高毕赤酵母工程菌（Mut+）植酸酶的表达量,对毕赤酵母工程菌50 L发酵生产植酸酶的工艺条件进行了研究。结果表明,通过流加葡萄糖提高菌体湿重到300 g/L,随后停止流加,溶氧回升后流加甲醇开始诱导,最终发酵结束时,植酸酶酶活达到21 666 U/mL,比对照提高12.9%,该诱导湿重有利于发酵生产植酸酶。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达

为避免α-葡聚糖造成的制糖过程中的糖分损失、制炼难度增加以及糖产品质量下降,利用α-葡聚糖酶分解而直接去除α-葡聚糖是目前最佳的选择.文中扩增了α-葡聚糖酶基因dex,构建组成型表达载体pGAPZαA-dex;以毕赤酵母KM71H为受体菌,将表达载体整合进入受体菌基因组,构建了组成型表达α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌.摇瓶发酵120h,α-葡聚糖酶酶活达到60.4U/mL,从而实现了α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达,使发酵过程无需使用甲醇进行诱导,提高了生产和使用安全性.     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。