人野生型p53基因的克隆及原核表达

利用RT PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段, 并将其克隆入原核表达载体pQE40中, 构建重组质粒pQE40-p53; 转化于E.coli M15宿主菌, 经IPTG诱导, 表达了N端融合6His的p53融合蛋白. 利用6His与Ni²⁺高亲合力结合的性质, 经镍柱纯化、 透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定, 结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.
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大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的利用基因重组技术在大肠杆菌中获得高效表达人过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从人cDNA文库中获得CAT编码基因,并利用pMAL-c2x构建了融合表达载体并进行了表达。结果融合表达可获得可溶性蛋白,此项研究为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆与原核表达

克隆出大肠杆菌编码葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的 gcd 基因,构建了诱导型表达载体pET28a-gcd,转化大肠杆菌E. coli BL21后获得阳性克隆菌株BL21/pET28a-gcd。IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析表明,该工程菌PQQGDH的表达量约为对照菌的18倍,约为18.2 mg/L,实现了高表达。此外,研究发现添加MgCl₂能提高PQQGDH的表达量。     

大肠杆菌ppsA,pckA基因的克隆与串联表达

磷酸烯醇丙酮酸合成酶（ppsA)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（pckA）是糖代谢中心途径中生成磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的2个关键酶，在大肠杆菌中分别由ppsA和pckA基因编码，首先用PCR方法从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增得到了ppsA和pckA基因，并将ppsA,pckA以单独或串联的方式克隆到大肠杆菌表达质粒pλPR上，构建成的质粒pλPR-ppsA,pλPR-pckA,pλPR-ppsA-PckA导入E.coli P2392菌株中表达，结果表明，ppsA,pckA基因的单独表达使宿主细胞的ppsA和pckA酶活力分别提高到5．2和2．5倍，串联表达使宿主细胞PAt和PckA酶活力分别提高到3．1和2．3倍，还使得以PEP为底物合成的3－脱氧α－阿拉伯 酮糖－7－磷酸（DAHP）产量提高到2．1倍，2个基因串联表达比单个基因表达更有利于提高DAHP的产量。     

链球菌Fc结合蛋白G基因的克隆与原核表达

为研制SPG相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从C群链球菌C40株基因组中扩增出了387 bp的细胞壁结合蛋白G(streptococcal protein G,SPG)基因,该基因编码125个氨基酸,包含了C1和C2两个Ig G结合结构域.构建了原核表达载体p ET28a(+)-SPG,IPTG诱导表达出分子质量约15.0 ku的SPG蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPG蛋白,Western blot分析表明纯化SPG蛋白具有生物学活性.     

运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以总DNA为模板，采用PCR技术克隆得到运动发酵单胞菌(Zymamonas mobilis）丙酮酸脱羧酶(pyru—Vate decarboxylase)基因pdc，将该基因连接到表达裁体pSE380上，得到重组质粒PSE—pdc,将此重组质粒转化到受体菌E．coliDH5α中，挑取重组菌株．经IPTG诱导后，在乙醛指示平板检测到丙酮酸脱羧酶活性．SDS—PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带：其分子量约为60KD．     

胸腺素α原基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

胸腺素α原(ProTα)作为一种免疫增强剂,对各种免疫缺陷疾病、病毒感染以及肿瘤都具有一定的作用.此外ProTα可以作为核蛋白参与细胞增殖,在肿瘤的预测、诊断及治疗中有一定应用.根据人胸腺素α原已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(P1/P2),应用RT-PCR法从中国人外周血中克隆到ProTα基因,将扩增产物连接到pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组质粒进行序列测定;同时用EcoRI和BamHI双酶切PCR产物,将该基因片断插入经同样双酶切的质粒pGEX 6P-1中,转化大肠杆菌BL21中进行表达.结果表明,克隆到的ProTα基因与参考的氨基酸同源性为99.70%;原核表达产物经过SDS-PAGE电泳分析,融合蛋白分子量为37 ku,主要以可溶形式存在.     

重组人尿激酶原基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT－PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因,用表达质粒pET29a构建了重组质粒pET29a/prouk,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,作为工程菌。经IPTG诱导表达,在46kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％。该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性。     

大肠杆菌麦芽糖转糖基酶 MalQ基因克隆与融合表达

用PCR方法获得E.coli K12 MalQ基因,将该基因插入原核表达载体pET-DsbA中,对质粒所含外源片段双向测序,并经BLAST比较分析,发现其与GenBank中报道的E.coli K12 MalQ基因的同源性高达99％。重组质粒转化E.coli BL21(DE3) plysS,经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示MalQ基因与DsbA表达的融合蛋白在目标位置约103kDa处有明显条带。经薄层层析分析粗酶液酶处理的麦芽三糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性     

SARS病毒E基因的克隆及原核表达

为了得到纯的SARS-CoV E蛋白以进一步研究其功能,通过Touch-down PCR程序,从SARS-CoV WHU cDNA(pMD18-T载体)文库中扩增了E基因,构建了重组质粒pGEX-E,并在Ecoli DH5α中进行了原核表达。SDS/PAGE及Western blot结果表明SARS病毒E蛋白的分子量约5 kDa,较预测的略小,并进一步分析了这种现象产生的可能原因。     

绵羊特异新基因OaN2片段的克隆及融合表达

为制备绵羊MHC区段1个新基因(OaN2)的特异性抗体及其表达模式和功能研究奠定基础,克隆OaN2的1个特殊片段(OaN2F,Genbank登录号:GQ244478)并做融合表达。以反转录得到的中国美利奴细毛羊的第一链cDNA为模板进行PCR扩增,并利用扩增产物构建重组质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α后诱导表达得到OaN2F和GST(谷胱甘肽S转移酶)的融合蛋白GST-OaN2F,将其纯化后鉴定。结果表明,成功克隆到了OaN2F(111bp)片段,并得到了纯化的30kD的GST-OaN2F融合蛋白。     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因，与质粒PBV220连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达，用SDS－PAGE电泳鉴定，在38kD处有一条明显的带，占菌体蛋白的20％左右，同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

小鼠OB基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织中扩增了OB基因,并利用定向克隆技术克隆至原核表达载体pTO-T7.将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot检测.表达产物利用亲和层析技术进行纯化.结果显示:表达的带有his标签的小鼠leptin融合蛋白,分子量约为20 ku.0.5 mmol/L的IPTG在37℃诱导2.5 h时,leptin融合蛋白的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上.表达产物经过纯化,纯度可达90%以上.Western-blot杂交显示,小鼠leptin融合蛋白有很强的抗原特异性.     

人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究目的：克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化．方法：从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV—EKL,转化大肠杆菌BL21（DE3）,调节温度至42℃诱导重组蛋白表达;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白．结果：所表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析,相对表观分子质量约为31kDa,表达量占菌体总可溶蛋白量的46％;通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性．结论：成功构建了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在生产和医学方面的应用研究奠定了基础．     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

八肋游仆虫蛋白激酶A的克隆及原核表达分析

为了研究低等真核生物中蛋白激酶PKA(cAMP-dependent protein kinase A)的生物学功能,以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)为实验材料,通过生物信息学方法分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,发现八肋游仆虫中编码蛋白激酶PKAc(PKA催化亚基)的基因只有一种。通过PCR扩增获得游仆虫PKAc基因(EoPKAc),分析表明EoPKAc基因全长1158bp,不含有内含子,开放阅读框981bp,编码326个氨基酸。序列比对结果显示EoPKAc含有与其它已知蛋白激酶相同的11个亚结构域(subdomain)以及一些重要的保守氨基酸。构建原核表达质粒pGEX-6P-1-PKAc,转化至大肠杆菌BL21中,EoPKAc获得高效表达,经GST柱亲和层析后获得较高纯度的EoPKAc蛋白,表达产物经Western blotting检测为阳性。