果蝇锌离子转运蛋白Catsup亚细胞定位分析

Catsup是果蝇体内一个功能重要的基因,其突变会导致体内多巴胺含量过高,引起果蝇致死及生殖障碍.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在确定蛋白的亚细胞定位进而在研究蛋白功能方面起着重要的作用.为了探索Catsup的亚细胞定位进而能够更好地研究Catsup的功能,文章利用基因工程技术和生物学方法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增Catsup基因全长,与GFP一起连接至pUAST质粒,构建载体pUAST-Catsup-GFP,通过显微注射技术导入果蝇,获得UAS-Catsup-GFP转基因果蝇.通过克隆验证了转基因果蝇构建成功.利用该果蝇进行Catsup的亚细胞定位,确定其定位在高尔基体上,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位

为确定拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-protein,AGP)的亚细胞定位,克隆了这个基因的编码区,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体,经农杆菌介导转化烟草BY-2悬浮细胞.利用激光扫描共聚焦显微镜,在稳定转化的BY-2细胞表面观察到绿色荧光.研究结果表明,此AGP分布在细胞膜表面.     

马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位

为了研究马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位情况,采用RT-PCR技术克隆到马铃薯StHb1基因cDNA序列,并成功构建了StHb1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pBI121-StHb1-GFP.利用农杆菌介导法将重组载体转化洋葱内表皮细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白的瞬时表达以确定StHb1蛋白在细胞内的分布.结果表明StHb1蛋白主要分布于细胞核中.     

水稻中两个同源异型结构域转录因子的亚细胞定位

为了对水稻同源异型结构域转录因子HD-ZipⅢ家族中的HDZ1和HDZ2进行亚细胞定位,利用RT-PCR技术从水稻cDNA中扩增HDZ1和HDZ2的编码区(去除终止密码子序列),与绿色荧光蛋白GFP编码框融合,构建2个转录因子的瞬时表达载体,采用农杆菌介导的转化方法转化至烟草中进行瞬时表达分析.结果表明:PCR扩增所得为目的基因片段HDZ1和HDZ2;二者与载体质粒pCAMBIA35S-GFP连接获得的融合表达载体成功移至烟草中并表达;确定HDZ1主要定位于烟草叶片的气孔中,而HDZ2定位于烟草表皮细胞的细胞膜上.二者在亚细胞中的定位不同,可能在水稻生长发育中所起的作用也不相同.     

拟南芥中一个镍离子转运蛋白的亚细胞定位

离子的跨膜转运是细胞获取养分的重要环节,亦是植物在组织和器官水平上进行养分吸收运移的基础．在植物中镍（Ni）元素主要以Ni^2＋的形式存在,并通过Ni^2＋转运蛋白将其跨膜转运至相应的组织器官,参与氢酶和脲酶的合成．生物信息学分析表明,拟南芥中一个Ni^2＋转运蛋白AT2G16800含有叶绿体定位信息．克隆该基因5’端编码转运肽的272bp片段,与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合后,在拟南芥中高效表达,对其进行了亚细胞定位的研究．转基因植株通过共聚焦扫描显微镜的观察,发现GFP荧光信号只存在于叶绿体中,该结果表明A他G16800为叶绿体蛋白．     

电穿孔法基因转染哺乳动物细胞的应用

应用电穿孔技术转染pEGFP于哺乳动物细胞，讨论了电穿孔技术的应用条件，影响因素，初步确定了COS7、Hela、HepG2、K562、Jurkat等细胞系的转染条件，为今后的分子生物学研究打下了良好的基础。     

高亲和力钠离子依赖二羧酸转运蛋白基因的克隆、表达及亚细胞定位研究

为了研究高亲和力钠离子依赖二羧酸转运蛋白(high affinity sodium-dependent dicarboxylate transporter,SDCT2,NaDC3)的功能,从小鼠肾组织中克隆出了其cDNA基因,并对其结构特征、基因表达谱及细胞内定位情况进行了分析。结果显示NaDC3蛋白由600个氨基酸组成,同源性分析表明其氨基酸序列与大鼠及人NaDC3分别有97％和87％相同。二级结构分析显示,该蛋白有13个跨膜α-螺旋区。Northern杂交显示该基因可在肾、肝、脑、胎盘等多种组织中表达。激光共聚焦显微镜观察显示该蛋白定位于肾小管上皮细胞膜上。     

日本沼虾感光细胞中Gq蛋白α亚基的鉴定与亚细胞定位

Gq蛋白是大多数无脊椎动物感光器中光信号传导中酶反应链的第二信使．本文用免疫印迹的方法研究了日本沼虾感光器中Gqa的存在，并应用免疫电镜技术观察了Gq蛋白在其感光器中亚细胞的分布，为研究Gq蛋白在光信号传导中的作用提供新的依据．     

绿色荧光蛋白基因mgfp4在水稻愈伤组织中的瞬时表达

采用基因枪方法将适用于高等植物的绿色荧光蛋白基因ｍｇｆｐ４转化到水稻愈伤组织之中,获得高效瞬时表达,在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察到强烈绿色荧光。绿色荧光蛋白ｍＧＦＰ４生色团形成迅速,转化４ｈ后就能观察到绿色荧光,并且持续时间较长,２ｄ后才基本消退。     

薄壳山核桃CiAGL6基因的克隆、亚细胞定位及表达

研究薄壳山核桃MADS-box转录因子CiAGL6基因的特性、亚细胞定位及在雌花不同发育时期的表达水平,为揭示薄壳山核桃成花分子机理提供理论依据。     

紫花苜蓿转录因子MsDREB1基因表达产物的亚细胞定位

利用生物信息学方法对紫花苜蓿MsDREBl进行了生物信息学分析．结果表明,该序列舍有AP2典型结构域,在N端存在核定位信号．为进一步验证该基因功能,构建MsDREBl与绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein,GFP）基因融合的植物表达载体pCAMBIAl302-MsDREBl,再利用基因枪将其转入洋葱表皮细胞,在共聚焦扫描显微镜下观察MsDREBl基因表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位．结果表明,MsDREBl基因表达产物定位于细胞核中,符合DREB家族转录因子特性．     

拟南芥中与ABA信号途径相关的两个同源未知基因的研究

本研究主要在实验室前期筛选出的两个编码同源未知基因AB(AB025622)和AC(AC023628)所构建的拟南芥过量表达和抑制表达转基因植株基础上对转AB基因拟南芥的生理性状进行初步分析以及在转录水平上分AB、AC和ABI1、ABI2在ABA影响下其表达情况.研究证明AB基因的过量表达导致植株对ABA不敏感,失水率增加,而AB的抑制表达导致植株对ABA敏感,降低了植株的失水率.初步证实AB参与ABA信号传导.此外,通过RNA的半定量分析可知在转录水平上AB、AC和ABI1、ABI2的表达量都受ABA诱导变化,证明ABA对野生型拟南芥植株生理性状的影响与控制AB、AC和ABI1、ABI2内源表达量有密切联系.     

拟南芥中一个参与热胁迫应答基因功能的初步研究

在拟南芥中发现了一个受热诱导的基因At4g19430,经Real time PCR分析表明该基因受热诱导后表达量显著升高.组织特性的分析发现其在拟南芥不同组织中均有表达,但在叶中表达量最高.亚细胞定位结果表明At4g19430蛋白定位在细胞质中.筛选并鉴定了该基因的突变体,并分析了其在热胁迫时的表型,结果表明该基因的突变体对热胁迫非常敏感,在热胁迫的条件下突变体存活率明显下降.     

Subcellular localization of chitosan oligosaccharides in living cells

Chitosan oligosaccharides （COS） is derived from the chemical or enzymatic decomposition of chitosan. The exact mechanisms underlying many biological functions of COS have not been elucidated. Since subcellular localization is very important in determining biological activity in a number of molecules, we used fluorescein isothiocyanate-labeled chitosan oligosaccharides （FITC- COS） and investigated the localization of COS in living cells by laser scanning microscopy. We found that COS entered cells in a dose- and time-dependent manner, and we first showed that COS may enter cells by facilitated passive diffusion and was preferentially localized in the mitochondria. While in high concentration, it was also found in the cytoplasm and nucleus and was enriched in the nucleolus and karyotheca. The different subcellular localization of COS suggested that they played different effects. Determination of COS subcellular localization in cells is important to help us understand the potent mechanisms underlying its multiple functions.     

Protein phosphorylation is involved in the water stress-induced ABA accumulation in the roots ofMalus hupehensis Rehd

Water stress-induced ABA accumulation plays a key role in the root to shoot communication and/or the cell to cell signaling under the soil stresses. The signaling of the water stress itself that leads to the accumulation, however, is less known. In this study, we subjected the roots of Malus hupehensis seedlings to water stress treatment and investigated the ABA accumulation in relation to protein phosphorylation. Our results showed that ABA accumulation could be substantially triggered in 40 min and reached 4 folds in 100 min after treatment with 30% PEG 6000 (polyethylene glycol). The water stress treatment also led to a substantial enhancement of total kinase activity, assessed with histone-Ⅲ as substrate, in 15 min and a maximum enhancement in 30 min before it declined to initial level. The Ca²⁺-dependent kinase activity showed a similar, if not more sensitive, trend. When the roots were fed with labeled ³²P- ATP, water stress enhanced the labeling of proteins, which showed a maximum labeling at 40 min. Two inhibitors of protein kinases, Quercetin and H7, effectively diminished or completely blocked the ABA accumulation under the stress treatment. It is therefore suggest that protein phosphorylation is involved in the signaling of the water stress-induced ABA accumulation.     

拟南芥CARK5激酶响应脱落酸信号的研究

为了研究拟南芥脱落酸（Abscisic acid,ABA）受体的翻译后修饰,本研究以能够磷酸化ABA受体的激酶CARK5作为研究对象,通过构建了转基因株系来检测CARK5在ABA信号途径中的功能.结果显示： CARK5能够促进ABA介导的抑制种子萌发、幼苗的形态建成以及主根的生长,但是过表达激酶失活型CARK5m（CARK5N250A）则跟突变体cark5表型类似.拟南芥中过表达CARK5增强植株抗旱性;ABA处理后,ABA响应标记基因RAB18表达量增加.这些结果说明,CARK5通过可以磷酸化ABA受体,正调控ABA信号通路.