肠道病毒71型SHZH03株VP1基因在毕赤酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichia pastoris 酵母宿主菌Gs115,以Myc-Tag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子.甲醇诱导表达.SDS-PAGE分析显示:表达产物的分子量约为30000,与天然VP1大小一致,ELISA实验表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性.     

肠道病毒71型外壳蛋白VP3在Pichia.pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导,筛选到5株高效表达VP3蛋白的工程菌株.ELISA实验表明:重组蛋白VP3具有较好的免疫原性.     

犬细小病毒新抗原变异株VP2基因的克隆与序列分析

目的鉴定犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)新抗原变异株的病毒型,为研究CPV变异及制备CPV特异性诊断和治疗试剂奠定基础。方法从病毒细胞培养物中提取基因组DNA,设计合成针对VP2基因的1对特异引物,PCR扩增出VP2基因片段,克隆后测序,应用DNAstar进行序列分析。结果得到CPV-VP-2基因序列15份,其中CPV-2a 10份,CPV-2b 5份;FPV-VP-2基因1份。结论各序列与已发表的标准序列比较,同源性在98%以上,未形成明显分支。     

犬细小病毒CPV-SHZ分离株VP2基因的克隆与序列分析

以本实验室分离鉴定犬细小病毒新疆石河子株（CPV-SHZ）的DNA为模板,根据基因库已发表CPV序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,进行聚合酶链式反应,扩增出约1.7kb的片段,按常规方法克隆进pMD18-T载体,经EcoR I和Sal I双酶切筛选到阳性质粒。测序得到VP2全基因组序列,并登陆Genbank（EU170352）。进一步对该片段进行序列分析,结果表明：所扩增基因片段长度为1755bp,与CPV参考株毒株V154（Type2a）、LCPV-V204（Type2b）、LCPV-V139（Type 2c（a））、LCPV-V203（Type 2c（a））,其核苷酸的同源性分别为99.32%、98.75%、98.97%、98.69%,确定CPV-SHZ株基因型为2a型,将其同我国和世界其他国家主要分离株进行基因系统发生进化关系分析,结果表明,其与我国北京分离株BJ018/07亲缘关系较近。     

研究获得肠道病毒71型精确结构

人类肠道病毒71型是一种引起手足口病的小RNA病毒（picornavirus）,会在儿童中引起可能致命的脑肿胀和瘫痪。现在,科学家们获得了肠道病毒71型与其抑制剂结合的精确结构,将帮助人们开发药物治疗这种病毒感染。文章发表在本周的美国《国家科学院院刊》（PNAS）杂志上。     

牛轮状病毒VP4、VP6、VP7基因分子生物学研究进展

轮状病毒是引起幼龄动物急性胃肠炎和腹泻的主要病因.犊牛感染轮转病毒会对集中饲养的牛群造成严重的经济损失,制约养牛产业的发展.轮状病毒的11个节段基因分别编码了6种结构蛋白(VP1-VP4,VP6,VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6),其中VP4和VP7与病毒的毒力密切相关,分别决定了病毒的P型和G型.VP6是病毒的特异性抗原,也是决定轮状病毒分组的重要蛋白.通过综述VP4、VP6、VP7的分子特征及研究进展,对目前开发的疫苗产品进行了简述.     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV—NM)提取总RNA，经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段，并构建至pGEM—T载体中。序列测定后，将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析：同源性为40％。通过PCR法标记克隆的cDNA片段，制备地高辛标记探针，与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交，并作敏感性试验，结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性，可检测出50pg的病毒RNA。     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5''端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northern blot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50 pg的病毒RNA.     

A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因遗传进化分析

对疑似感染FMDV的样本进行了FMDV VP1基因RT-PCR鉴定,测定了其中1个阳性样本序列(命名为HY).采用生物信息学软件比较了HY与参考序列的同源性,并构建VP1基因的分子系统树.结果表明:HY属A型FMDV亚洲拓扑型东南亚-97谱系,与我国近年来报道的A/GDMM/CHA/2013的序列相似性为99.1%,与AF/72疫苗株的相似性仅为79.0%.提示我国近年来报道的A型毒株与AF/72疫苗株的序列差异较大,应及时更换A型口蹄疫疫苗毒株.     

用PCR扩增和克隆鸡贫血病毒衣壳蛋白VP2基因

接种鸡贫血病毒（ＣＡＶ）Ｃｕｘ－１毒株于ＭＤＣＣ－ＲＰ１细胞中,并用经狄高辛标记的ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ１基因克隆ＤＮＡ作为探针在斑点杂交中检测和比较了各代细胞中ＣＡＶ ＤＮＡ水平。通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从ＣＡＶ ＤＮＡ水平较高的ＭＤＣＣ－ＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ２基因片段约６５０ｂｐ的编码序列,将该ＰＣＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点克隆到ｐＵＣ１９质粒载体中,     

鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析。结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%~99.8%,氨基酸同源性为96.5%~99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。     

共表达鸡IBDV VP2和IL-2基因的重组毕赤酵母的构建及免疫原性

通过重叠延伸PCR扩增IL2-VP2串联基因,克隆到pMD18-T载体上,亚克隆正向插入到毕赤酵母表达质粒pPICZαA中,经PCR和双酶切鉴定表明成功构建了酵母重组表达载体pPICZαA-IL2-VP2。将该重组质粒线性化后电击转化入感受态毕赤酵母X-33菌株,构建成分泌型表达IL2-VP2的酵母工程菌株。经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE、Western-blot活性检测分析表明IL2-VP2基因长度为1.85kb,包含缺失了TAA终止密码子的IL-2基因和缺失了ATG起始密码子的VP2基因,两个基因之间以高度柔韧性的(Gly-Gly-Gly-Ser)编码核苷酸相连接,并在该体系中得到分泌表达,分子量约为50kD,且表达产物对传染性法囊病毒具有较好的反应原性。     

Molecular epidemiology and evolution of worldwide enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 2004

Human enterovirus 71 （EV71） is one of the major etiological agents of the hand-foot-and-mouth disease （HFMD） that often causes severe neurological complications. Recently, its outbreaks mainly take place in the torrid zone of the Asia-Pacific region. To study the evolution and genetic variability, we collected 532 EV71 strains with almost complete or complete VP1 sequences （891 nt） isolated worldwide from 1970 to 2004. The pairwise homologies and genetic distances were analyzed. Most strains belong to previously identified genotype B and C. However, a unique strain R13223-1ND-01 appears not to fall into current three genotypes （A, B and C）, and probably represents a new genotype D. Some orphan strains were observed in the genotypes B and C, and their significance in the EV71 evolution was discussed. Moreover, there is a significant co-variance of 6 discrete positions on VP1 （amino acid 43, 58, 164, 184, 240 and 249）. This high co-variability is tightly related with the subgenotypes.     

Au@P4VP纳米复合粒子的制备与性能

本文首先采用RAFT聚合法合成了端基为双硫酯的聚-4-乙烯基吡啶(P4VP),进一步使用NaBH4还原得到端基为巯基的P4VP,最后通过原位还原法在HAuCl4水溶液中合成了Au@P4VP纳米复合粒子(Au@P4VP NPs).通过UV-vis、FT-IR、XRD、SEM、DLS及TEM等手段表征其结构,证明成功合成了金纳米复合粒子.研究表明:金纳米复合粒子的粒径和形貌与P4VP的浓度及溶液的pH值有关.当P4VP和HAuCl4的物质的量之比为2时,得到的金纳米粒子的形貌和粒径最好;在P4VP的物质的量很小时,得到了三角形和不规则形状的金纳米粒子.当金纳米复合粒子溶液的pH3.2时,得到的纳米粒子具有很好的分散性且粒径较小;若溶液的pH3.2,得到的纳米粒子粒径较大,且发生一定程度的团聚.     

对虾白斑综合症病毒(WSSV)结构蛋白VP28与VP26的功能分析

对虾白斑综合症病毒(W SSV)结构蛋白功能的研究数据还不多。怎样预测并验证那些新发现的蛋白功能,为实验研究提供理论参考,是功能基因及结构蛋白的研究重点之一。利用生物信息学技术对获得的W SSV相关数据进行分析和归纳。分析数据显示结构蛋白VP28与VP26在二级结构和跨膜结构域等方面具有很高的相似度;而且,这两个蛋白与任何已知的蛋白序列没有明显的同源性,但二者的氨基酸序列彼此间具45%的相似性,提示这两个蛋白可能执行相似的生理功能。一个特别设计的细胞吸附实验用于进一步研究W SSV侵染宿主细胞的过程中VP28和VP26所扮演的角色。实验结果显示,两个蛋白均可以与对虾鳃组织来源的细胞发生特异的体外吸附,表明VP28和VP26可能参与W SSV侵染宿主细胞的初始阶段。     

轮状病毒VP7基因的克隆及核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了916bp的VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-V7中含有轮状病毒的VP7基因片段。经核苷酸序列分析，表明正确克服了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区。