非洲爪蟾卵非细胞体系中星体的组装及其在核膜重建中的作用

报道了由微管组成的星体在爪蟾卵细胞提取物中的组装过程、动态变化及其在核膜装配过程中的作用. 用精子染色质在爪蟾卵非细胞体系中诱导细胞核重建. 在初期阶段, 总是在精子染色质基部的中心体周围通过微管装配而形成星体. 随着星体的形成, 具有DNA复制功能的细胞核逐步装配. 当完整的细胞核形成后, 星体开始去组装直至消失. 在实验体系中加入微管装配特异抑制剂秋水仙素, 可以有效地抑制星体的组装, 核膜的组装同时受到严重的影响. 高浓度的秋水仙素还抑制核膜膜泡的融合. 若加入微管稳定剂紫杉醇, 微管可以装配, 并在染色质周围形成大而稳定的星体. 在此情况下, 核膜的装配也受到严重影响. 观察发现, 在此被稳定的星体中, 有转运受阻的膜泡存在. 基于以上实验结果, 认为由微管组成的星体在核膜重建中具有重要的作用, 其机制可能是微管参与核膜前体物质向染色质表面的输运.     

爪蟾卵非细胞体系诱导小鼠肝细胞核凋亡

通过向正常爪蟾卵提取物S_150中加入dATP和细胞色素c,得到能有效诱导外源细胞核凋亡的非细胞体系 .温育在上述非细胞体系中的小鼠肝细胞核表现出明显的凋亡特征并形成大量的凋亡小体 .染色质在核膜下凝集形成直径相差较大并相互分离的球形区域 ,球形小体通过核膜向外突出 ,并逐渐与核膜分离 .最后 ,细胞核几乎将所有DNA凝集并排出 ,只在核膜边缘残留一些DNA成分 ,而温育体系中充满高度凝集的凋亡小体 .这种凋亡小体产生的过程以往工作未见描述 .同时 ,小鼠肝细胞核在卵提取物中发生的形态变化伴随着染色质DNA被降解成DNAladder.我们的研究表明 ,利用爪蟾卵提取物研究细胞核凋亡是一个很好的实验模式 .     

角蛋白在诱导细胞凋亡的爪蟾卵提取物中发生特异降解

细胞色素Ｃ加入非洲爪蟾（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵提取物Ｓ－１５０,激活爪蟾凋亡特异蛋白酶ＸＣＰＰ３２,诱导非细胞体系凋半随凋亡诱导过程,卵提取物Ｓ－１５０表现出一定的变化,其蛋白组成,特别是骨蛋白变化明显,Ｗｅｓｔｅｒｎ检测证明爪蟾卵提取物中４２ｋｕ酸性角蛋白被ＳＣＰＰ３２特异降解。酸性角蛋白降低在凋亡过程中可能具有重要作用。     

非细胞体系核重建的原子力显微镜观察

非细胞体系是研究有丝分裂中核重建过程的重要方法. 原子力显微镜以其高分辨成像的功能已成为观察生物体系的有力工具, 但目前原子力显微镜在非细胞体系研究中的应用还未见报道. 提出了一种适用于原子力显微镜观察的空气干燥样品制备方法, 利用原子力显微镜观察了非细胞体系核重建过程, 得到了高分辨、高质量的非细胞体系核重建过程的形貌像, 并且清晰地分辨出直径为100 nm的膜泡和它在接近染色质表面的形态变化. 为进一步了解核膜的重建机理提供了方向.     

爪蟾卵提取物中凋亡特异核酸酶抑制物的鉴定

细胞色素c加至非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵提取物S－150中,能诱导外源细胞核发生凋亡。诱导过程中,爪蟾凋亡特异核酸酶XAD被激活,在核小体间切割染色质,形成DNA梯（ladder).实验表明,正常卵提取物中大量存在凋亡特异核酸酶XAD抑制因子IXAD,抑制XAD的核酸酶活性;IXAD分子量约40ku,正常状态下以二聚体形成或与XAD形成复合体存在;凋亡中IXAD被降解,导致XAD被释放激活。Western检测和交叉抑制实验显示IXAD与DFF45在结构与功能上可能同源。实验结果进一步证明凋亡途径在进化上的保守性。     

植物非细胞凋亡体系的构建

为了研究植物细胞的的凋亡机制,利用热激诱导凋亡的烟草细胞中的胞质溶胶,构建了植物非细胞凋亡体系,温育在此体系中的正常烟草细胞核,出现染色持固缩,形成凋亡小体等典型的细胞凋亡的形态学特征,ＤＮＡ电泳分析观察到核小体间ＤＮＡ断裂所形成的梯状条带,将细胞核进行了彗星电泳观测到彗星状的核ＤＮＡ片段的迁移,抑制剂研究发现ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ,ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ及ＥＤＴＡ均不能抑制上述形态学变化及生化变化,而     

衣藻肌动蛋白-绿色荧光蛋白的融合基因在烟草悬浮细胞中的表达及融合蛋白的体外聚合

将衣灌（Chlamydomonas reinhardtii)肌动蛋白（actin）基因(cDNA)与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP)基因融合后,分别构建到原核和植物表达载体中,并在BL21plus细菌和烟草悬浮细胞（BY-2）中进行表达。通过荧光显微镜观测到重组后的融合蛋白在菌体和烟草悬浮细胞中得到正确表达。肌动蛋白-绿色荧光蛋白 的融合蛋白主要分布在烟草悬浮细胞细胞膜周围,参与膜骨架的组成,另外还大量分布于细胞核周围和细胞板的位置,同时也在细胞内形成丝状结构,参与F-actin的组成。将肌动蛋白-绿色荧光蛋白融合基因的原核表达产物经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和疏水柱层析后,得以纯化,并在纯化产物中加入肌动蛋白聚合缓冲液,纯化的肌动蛋白能聚合成为丝状结构即F-actin,这表明低等藻类的肌动蛋白具有同高等植物和动物相似的性质和功能。     

小鼠胸腺T淋巴细胞有丝分裂过程中核纤层蛋白A/C与染色体结合

核纤层(nuclear lamina)是内层核膜下由10nm纤维构成的网架,是核骨架的结构组分之一,哺乳类细胞的核纤层蛋白(lamin)成分可分成3种:lamin A,lamin B,lamin C.核纤层与核膜、染色质及核膜孔复合体在结构上有密切联系.可能具有支持核膜,为间期染色质提供锚定位点的功能.淋巴细胞核纤层的成分尚有争议,Rober等报道没有发现lamin A/C;而Guilly等的结果显示在淋巴细胞(T和B)分化的早期(包括淋巴母细胞,胸腺淋巴细胞)     

含羞草碱可与脱氧胸苷三磷酸在DNA复制点直接竞争

含羞草碱,一种植物氨基酸,是一种可逆的细胞周期抑制,生物化学研究发现,含羞草碱可以在靠近Ｇ１／Ｓ交界的多种水平上起作用,用微注射方法证实,含羞草碱对未孵化非洲爪蟾卵核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）的复制有可逆性抑制作用,此外,含羞草碱与胸腺嘧啶化学结构的高度相似性说明,含羞草碱很有可能在ＤＮＡ复制过程中直接与胸腺嘧啶进行竞争以阻止ＤＮＡ复帽起始及（或）链延伸,这一结果对进一步确立含羞草碱的作用机制具有重要     

细胞色素c诱导胡萝卜细胞核的体外凋亡

在胡萝卜细胞胞浆提取物ＣＳ－１００中加入ＣｙｔＣ可建成高效诱导细胞凋亡的植物非细胞体系,在瞎术诱导体系中,温育的胡萝卜细胞核在表现典型的凋亡形态学特征的同时,其ＤＮＡ发生特异缓解形成ＤＮＡＬａｄｄｅｒ,ＴＵＮＥＬ实验也说明ＤＮＡ发生了３′－ＯＨ特异断裂,研究表明,ＣＳ－１００非细胞体系是研究植物细胞凋亡机理的一个很好的,方便在实验模式,在植物细胞凋亡过程中可能存在与动物细胞凋亡相似的机制。     

水稻中一种RNA结合蛋白cDNA的筛选和结构分析

植物叶绿体基因组全结构的阐明,已充分揭示该遗传体系兼有原核生物和真核生物基因组的特征。在叶绿体基因中,除存在一些内含子结构外,还具有像rpl12这样复杂的分割式基因。同时,不同基因的转录速度也存在着显著的差异。这些都意味着叶绿体基因在转录后必然有着复杂的剪接加工过程。RNA结合蛋白是一类在RNA加工中起重要作用的蛋白。Li等首次从烟草叶绿体中分离到与RNA转录直接相关的RNA结合蛋白,并且证明它们是由细胞核编码,在细胞质中合成后再输入到叶绿体中去的。至今,已从烟草、菠菜以及拟南芥菜等植物中发现了约10种核编码的叶绿体RNA结合蛋白,它们有类似的构造特征。我们从水稻cDNA文库中首次筛选到一个RNA结合蛋白(cp28)的基因,其相应的肽链由264个氨基酸组成。和其他叶绿体RNA结合蛋白相仿,它也包含有两个RNA结合结构域(称为consensus sequence-type RNA-binding domain,即CS-RBD),其中各含有一个由8个氨基酸组成的高度保守的一致顺序(ribonucleoprotein consensus sequence,即RNP-CS)。N端区域的传送肽(穿膜信号肽)由60个氨基酸组成,其后是一段负电荷十分集中的酸性肽段,但传送肽和酸性肽段的氨基酸顺序与其他植物的RNA结合蛋白的同源性很低。根据全长肽链的同源性比较,我们还分析了水稻cp28     

人ε-珠蛋白基因5''旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε－珠蛋白基因的Ｋ５６２细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白（简称ε－ＮＭＰｋ）,它能专一与正调控元件ε－ＰＲＥ－ⅡＤＮＡ（－４４￣４１９ｂｐ）相结合,Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,－ε－ＮＭＰｋ是由２个分子量约为４０ｋｕ的亚基所组成,还发现在Ｋ５６２,ＨＥＬ和Ｒａｊｉ细胞中都至少存在着１个核基质蛋白,它们能ε－珠蛋白基因５′旁侧ＤＮＡ序列     

真细菌型的细胞分裂位点决定因子CrMinD基因在衣藻中从叶绿体到核的成功转移

MinD蛋白是一种普遍存在的ATP酶, 在真细菌、古细菌以及植物叶绿体的分裂过程中发挥着关键的作用. 在已研究过的4种绿藻(Mesostigma viride, Nephroselmis olivacea, Chlorella vulgaris, Prototheca wicker-hamii)中, MinD基因均由叶绿体基因组编码. 但在拟南芥中, MinD基因由核基因组编码, 其蛋白定位于叶绿体并参与叶绿体分裂的调控, 说明在高等陆生植物中, MinD基因已经转移到核基因组. 然而, 对于在质体进化过程中MinD基因从叶绿体转移至核的机制还不清楚. 我们从单细胞绿藻(Chlamydomonas reinhardtii, 衣藻)中鉴定了一个核编码的MinD同源物CrMinD, 其在野生型大肠杆菌(E. coli)中的过表达会抑制细胞的分裂并导致丝状细胞的形成, 表明植物MinD蛋白在进化上的保守性. CrMinD-egfp在烟草和拟南芥中的瞬时表达确认了CrMinD蛋白在调节叶绿体分裂中的作用. 在已公布的所有陆生植物质体基因组序列中, 没有发现MinD的同源物, 说明MinD基因从质体转移至核这一事件在进化出陆生植物以前就已经发生了.     

人ε-珠蛋白基因5'旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε－珠蛋白基因的Ｋ５６２细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白（简称ε－ＮＭＰｋ）,它能专一地与正调控元件ε－ＰＨＥⅡ　ＤＮＡ（－４４６～－４１９ｂｐ）相结合,Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,ε－ＮＭＰｋ是由 ２个分子量约为４０ｋｕ的亚基所组成．还发现在 Ｋ５６２,ＨＥＬ和 Ｒａｊｉ细胞中都至少存在着１个核基质蛋白,它们能与ε－珠蛋白基因 ５’旁侧 ＤＮＡ序列内的沉默子 ＤＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｅｒ,－３９２～－１７７ｂｐ）相结合,它们的结合区带（ｂａｎｄ Ｋ与ｂａｎｄＨ／Ｒ）位置并不完全相同,推测在ＨＥＬ和Ｒａｊｉ细胞内可能共同存在着一个与沉默子ＤＮＡ专一结合的核基质蛋白．实验结果表明,核基质蛋白可能积极参与了人ε－珠蛋白基因时空表达的调控．     

以胚胎干细胞为核供体能促进异种重构胚的体外发育

体细胞在异种成熟的去核卵母细胞中能够去分化和重编程,并能发育到囊胚,甚至能全程发育正常出生。为了评价胚胎干细胞作为供核细胞在异种动物克隆中的意义,以小鼠胚胎干细胞（ES）为核供体,兔成熟的去核卵母细胞为受体构建异种重构胚,分析其在体外的发育能力,并以小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠外耳皮肤的成纤维细胞为对照。通过核移植的方法分别把3种细胞移入成熟的兔去核卵母细胞透明带下,经电融合和激活后,在体外培养,胚胎干细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚在体外发育到囊胚的比例为16.1％,明显高于用成年小鼠外耳皮肤成纤维细胞（0％～3.1％,P<0.05）和小鼠胚胎成纤维细胞（2.1％～3.7％,P<0.05）所构建的异种重构胚的体外囊胚发育率.重构囊胚细胞经染色体分析,证实其染色体来源于小鼠胚胎干细胞。以上结果显示,用胚胎干细胞作为供核细胞,比体细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚更容易进行重编程,并且胚胎干细胞指导异种克隆胚胎正常发育的能力强于体细胞。     

转基因烟草分析COP1亚细胞定位及各结构域的功能

植物体内存在着非常精巧的光信号调节系统以适应外界光环境的变化，COP1蛋白是这个调节系统中介导光信号转导的一个关键因子。利用从豌豆克隆的COP1的cDNA，根据豌豆COP1的蛋白结构设计了4种不同的结构域基因片段，构建了这4个片段及COP1全基因与GFP融合基因的植物表达载体，通过根癌农杆菌分别转化烟草。利用由原核表达的GFP－COP1融合蛋白制备的抗体和GFP基因片段制成的放射性探针，通过Southern和免疫印迹实验证实各种外源融合基因在转基因烟草中均获得了组成型的变化，发现：（1）烟草内源COP1的分子量为76ku，在各器官组成型存在，光照条件对其含量影响不大；（2）COP1的细胞核定位域在其核－质分配的调节中起着关键作用。含有核定位域的目的蛋白在叶表皮细胞中的亚细胞定位受光调节，而在根细胞则组成型定位于细胞中；（3）Couiled-coil域对COP1的功能十分重要，而锌指结构域起辅助作用；（4）WD－40重复结构域起着关键作用，但单独的WD－40重复结构域不影响光形态发生；（5）过量表达COP1不仅导致烟草地上部分光形态发生受抑制，而且还导致短的簇生根发生。相反，过量表达不含WD－40重复结构域的COP1则促进地上部分光形态发生，并导致根部伸长，但无侧根。COP1－COP1相互作用不仅可以在细胞核中发生，而且可在细胞质中发生。这一实验系统为今后深入研究COP1的结构与功能打下了一个良好的基础。     

强MAR的分离及其体内外功能鉴定

将MAR（matrix attachment region)构建到外源基因表达盒两侧可以促进外源基因的表达克服基因沉默。用PCR方法从烟草和拟南芥中分离到4个新的MAR序列（TM2，TM3，AM1和AM2），以水稻悬浮细胞为材料，提取大量细胞核制备核基质，以已发表的MAR（TM1）和对照，对4个新MARs序列进行体外结合实验，结果表明TM2和TM3与核基质的结合能力强于已知MAR序列。将4个新MARs和对照分别顺向构建和表达载体pBI121 gus基因表达盒两侧，用农杆菌介导法转化烟草，获得转基因植株。对转基因植株体内GUS酶活性检测表明，TM1，TM2，TM3和AM1均能命名外源基因表达增强，其中TM2增强5倍，TM1增强1．5倍，TM2增强效果强于对照TM1。表明分离到一个新的强MAR，可以用于高效表达载体的构建。对5个MARs的序列特征、体外结合能力及外源基因表达影响三者之间的关系进行了分析，并对获得的强MAR在植物基因工程中的应用进行了讨论。     

膜去极化激活的PKC抑制依赖生肌素的AChRγ基因启动子活性

烟碱样乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor,AChR）是由4种亚基组成的五聚体,其表达受神经电活动控制。胚胎期神经植入前,AChR弥散分布于肌细胞表面;突触发生后,突触外AChR表达受抑制,而集中于突触后膜表达。出生后去神经或用特异的Na~ 通道阻断剂阻断电活动可引起骨骼肌组织突触外AChR mRNA明显升高。电刺激去神经的肌肉又可使突触外AChR基因表达关闭。因此,有关膜去极化与AChR基因转录激活的偶联机制研究已成为当前愈发感兴趣的课题。Klarsfeld等利用特异的阻断剂证明,电活动抑制AChR的生物合成涉及Ca~（2 ）和PKC的作用。huang等发现,Ca~（2 ）通过去极化的膜由L型钙离子通道进入胞浆,可引起AChR基因快速失活;膜去极化可引起核内PKC活性升高,进而导致AChR基因表达所必需的1个因子磷酸化而失活。Neville等根据神经和电刺激后基因表达动力     

核基质和染色体骨架与端粒DNA和c-Ras基因关系的研究

核基质(Nuclear matrix)是存在于真核细胞核内的以蛋白成分为主的水不溶性纤维网络体系.近年来的广泛研究表明该体系不仅是维持细胞核形态的支架,而且在DNA复制、基因表达的调节、核内激素的结合等方面起着十分重要的作用.染色体骨架(Chromosome scaf-fold)是中期染色体中去除DNA与组蛋白后得到的由非组蛋白构成的支架结构.有资料表明染色体骨架可能来自于核基质:Bakers等人对粘菌(Physarum polycephalum)有丝分裂周     

基质金属蛋白酶系统与卵巢功能调节

哺乳动物的大多数器官在形成后,极少出现周期性的组织重建.然而,雌性动物的生殖系统,包括子宫内膜、乳腺、卵巢卵泡和黄体等在生殖周期或生命过程中的不同阶段经历着生长、成熟和萎缩等周期性变化.这些动态组织的变更要求细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的不断重建.ECM成分包含蛋白和非蛋白分子,它们形成具有组织特异性的细胞黏附结构.其中基质蛋白与其细胞受体的相互