解脂耶氏酵母异源合成类胡萝卜素的研究进展

类胡萝卜素是一类具有红色或橙黄色的四萜类化合物,具有强抗氧化能力,被广泛地应用于食品、医药、饲料等行业,传统的生产方法是化学合成、植物提取。解脂耶氏酵母是一种安全的产油酵母,具有充足的类胡萝卜素积累前体和良好的胞内疏水性环境,是类胡萝卜素异源生物合成的理想宿主。近年来,国内外普遍采取合成生物学的策略,在解脂耶氏酵母中构建并优化类胡萝卜素的合成途径,实现其异源高水平合成。综述了近年来解脂耶氏酵母异源合成类胡萝卜素的研究进展,并对未来的研究进行了展望。     

解脂耶氏酵母利用甘蔗渣发酵产赤藓醇

甘蔗渣是一种常见的固体废弃物,含多种营养成分,然而目前尚无有效地利用手段.研究以解脂耶氏(Yarrowia lipolytica)为发酵菌株,以甘蔗渣为唯一碳源,进行赤藓醇发酵生产.结果发现,甘蔗渣作为赤藓醇发酵碳源的最佳添加量为30.0 g/L;经优化,甘蔗渣发酵赤藓醇的最佳氮源为(NH4)2S2O8,添加浓度为3.0 g/L时,赤藓醇产量达到最高;当发酵培养基中添加60.0 g/L的NaCl所产生的渗透压最有利于赤藓醇生成.同时,添加10 mg/L的Mn2+和4mg/L的Cu2+可进一步促进赤藓醇合成.在最优条件下发酵168 h,赤藓醇的产量达到峰值18.9 g/L,产率为63%.结果表明,甘蔗渣可以作为唯一碳源发酵产赤藓醇,该发酵工艺为降低赤藓醇发酵成本及甘蔗渣再利用探究了一条新途径.     

解脂耶氏酵母yPPI基因的克隆与功能研究

用硫酸二甲酯诱变解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）野生型菌株，获得了不能在油酸作惟一碳源的培养基上生长的突变株.通过功能互补突变株在含油酸的培养基上的生长，从解脂耶氏酵母基因组文库中克隆了一个基因.同源性比较发现，该基因产物与广泛分布于各种生物体中的亲环素类的肽基脯氨酰顺反异构酶（PPI）有较高的同源性，因此将该基因命名为yPPI.电子显微镜下观察发现，yPPI基因突变株发生了一系列明显的结构变化，在其细胞核的周围出现了许多膜系结构，且细胞内没有过氧化物酶体.免疫荧光分析表明，yPPI基因突变细胞的过氧化物酶体基质蛋白能够正常地合成，但它们不是定位于过氧化物酶体内，而是均匀地分布于细胞质中.这些结果表明yPPI的存在与过氧化物体的形成和过氧化物酶体基质蛋白的正确定位有着密切的关系，证明了亲环素类肽基脯氨酰顺反异构酶对过氧化物酶体的生物合成作用.     

解脂假丝酵母胞外脂肪酶的提纯和性质

通过ＤＥＡＥ－ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＤＥ－５２和ＤＥＡＥ－ＳｅＰｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析等提纯步骤，对解脂假丝酵母胞外脂肪酶进行了纯化，得到了层析纯样品，比活提高２７．４倍，得率１１％．该酶反应最适温度为４０℃；最适ＰＨ为７．５；等电点约在ＰＨ４．５～５．０之间；８℃以下存放，酶活力损失较少，３０℃以上存放，酶活力有明显损失．金属离子Ｓｒ２＋，Ｂａ２＋，Ｚｎ２＋和Ｍｇ２＋对该酶的激活作用为Ｓｒ２＋＞Ｂａ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｍｇ２＋．Ｃｕ２＋和Ｎａ＋对酶活性有抑制作用．ＮａＮ３对保持酶活性有重要作用．     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

温和化学渗透剂对解脂假丝酵母神经酰胺含量的影响

为了分析温和化学渗透剂木瓜蛋白酶、甘氨酸对解脂假丝酵母33M Candida lipolytica中神经酰胺含量的影响,分别采用氯仿甲醇抽提法和乙醇抽提法提取神经酰胺,用固相萃取法（SPE）分离神经酰胺与其它膜中脂类,并用薄层色谱（TLC）方法和高效液相色谱-蒸发光散射器（HPLC-ELSD）对其进行定性和定量分析,结果表明：加温和化学渗透剂木瓜蛋白酶、甘氨酸能增加解脂假丝酵母中的神经酰胺含量,并以木瓜蛋白酶效果最好。     

碳苷型半乳糖甘油单脂类似物的合成

以五乙酰基保护的D-半乳糖为初始物,经立体选择性烯丙基化、碱性高锰酸钾氧化、选择性酯化及水合肼脱保护,以简便有效的方法,合成了一类新型碳苷半乳糖甘油单脂天然产物类似物——1-O-酰基-2-羟基-3-α-D-吡喃半乳糖基丙脂。     

粘红酵母产L-苯丙氨酸解氨酶的研究

对粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)产生L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)的产酶条件进行了研究.结果表明粘红酵母产酶最佳条件为培养基／g*L－1;葡萄糖5．0,豆饼水解液10．0(以氨基酸计),KH2PO40．5,Ph5．5;接种量5%,摇瓶转速170r／min,28℃培养15h后添加L-苯丙氨酸至终质量浓度0．5g·     

杨树木屑废弃物酶解液发酵制备富硒酵母的研究

以杨树木屑为原料,考察了固液比、酶添加量、pH和酶解时间对其酶解效果的影响。通过优化酶解条件制得葡萄糖质量浓度为55 g/L的酶解液,将酶解液作为碳源替代传统培养基中的葡萄糖,其他营养成分不变,发酵制备富硒酵母,重点研究了酵母菌在酶解液中的生长情况和富硒能力。结果表明,酵母在酶解液培养基中长势良好,5 L发酵罐发酵36 h后,每L发酵液酵母干重23.9 g,单位酵母硒含量超过3 500 μg/g。     

脂酶催化下选择性合成单酸甘油酯的研究

脂酶存在下,在有机溶剂中进行甘油和硬脂酸甲酯的酯交换反应,以60%以上的转换率合成出单酸甘油酯（MG）,而甘油二酯（DG）的生成率抑制在2%以下.经多种脂酶的对比试验,证明porcine胰脂酶（PPL）最适于本反应.通过改变基质、PPL浓度、反应温度等,从反应活性及反应选择性两方面选定了最佳条件.通过将多种脂肪酸甲酯运用于本反应,发现反应活性与脂肪酸的结构紧密相关,链愈短向MG的初始反应速度加快,但向DG的转换亦加快,结果MG的选择性下降.     

酵母Yarrowia lipolytica的密码子用法分析

分析了酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ的４３个蛋白编码基因的同义密码子使用情况。计算了酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ的密友子地;首镒确定出了母Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｉｃａ的１７个视表达优越密码子。这些结果与已知的酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中的密码子用法存在较大的差别,说明Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ有特有的密码子用法。     

圣女果中番茄红素的提取方法及其抗氧化效果研究

以香油为溶剂,从圣女果中提取番茄红素.通过测定吸光度表征提取物对羟自由基的清除率,并对其抗氧化效果进行研究.实验结果表明,用香油作溶剂,料液比为1∶1,萃取4 h,所得提取液具有较好的抗氧化效果.     

外源基因在大肠杆菌中表达的优化

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但基因的表达受多种因素的影响,现就各种影响因素综述了外源基因表达的优化策略,这将有助于采取有效方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率.     

人工诱导盘鲍异源雌核发育多倍体的初步研究

通过预实验,观察和了解在24.8℃下九孔鲍精子与盘鲍卵子授精,及其受精卵第一极体和第二极体出现的时间.采用不同浓度的乙烯脲失活九孔鲍精子的遗传物质,确定其最佳处理浓度和处理时间.遗传物质失活的九孔鲍精子和盘鲍卵子授精,用CB进行不同持续处理时间抑制受精卵第一极体和第二极体出现的方法诱导多倍体.实验结果表明,在水温24.8℃下,作为失活九孔鲍精子遗传物质的乙烯脲,当其质量分数为0.5‰和处理时间为10 min是比较适宜的;用遗传物质失活的九孔鲍精子与盘鲍卵子授精,在授精后10 min,用浓度为1.0 mg.dm-3的CB持续处理受精卵24 min,表观三倍体率达65%以上,表观四倍体率达5%左右.稚鲍的倍性检查中,雌核发育多倍体占总多倍体数的80%,杂交多倍体占20%.盘鲍异源雌核发育的三倍体率达到93%,四倍体率为3%左右.     

rDNA介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用

根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增特定的2．2kb rDNA片段,并以此替换酿酒酵母(Saccharomyces cereristae)整合载体YIp5的URA3片段;在此基础上,引入G418抗性基因KanMX和酵母磷酸甘油激酶(phosphoglycerale kinase,PGK)组成型强启动子和终止子序列(PGKp-t),构建适合酿酒酵母工业菌株高拷贝整合表达载体pYMIKP,以细菌木糖异构酶(xylose isomerase,XI)基因xy/A为目标基因,通过载体pYMIKP引入到酵母工业菌株NAN-27中,酵母转化子在非选择培养条件下,连续生长50世代质粒稳定性为99．72％,目标基因高拷贝重组菌的木糖异构酶比酶活是对照菌株的67．2倍,达到0．672U／mg蛋白,实现了外源基因在酿酒酵母工业菌株中的稳定高效表达。     

培养条件对甲醇毕赤酵母异源表达木质素过氧化物酶的影响

对含有黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(LipH8)的甲醇毕赤酵母培养基和发酵方法进行了研究．摇瓶培养条件研究结果表明:用11°Bx麦芽汁培养工程菌,然后用高温浸提液置换诱导产酶较好．5 L发酵罐产酶放大实验结果表明,木质素过氧化物酶较稳定,在72 h木质素过氧化物酶酶活达到最高7 568 U/L．     

厦门霉素生物合成基因簇在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中的异源表达

将携带有厦门霉素生物合成的整合质粒p LMO09404,通过供体菌大肠杆菌ET12567(p UZ8002)与受体菌白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008进行接合转移,将得到的接合转移菌株经PCR验证后进行发酵,发酵液经HPLC和质谱检测.结果显示,厦门链霉菌来源厦门霉素基因簇可以在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中异源表达.     

番茄红素粗提液中质量浓度测定方法的研究

研究不同测定方法对番茄红素粗提液质量浓度测定的影响.以丙酮、乙酸乙酯和正己烷在低温、避光条件下提取番茄红素,并在300～600 nm区间进行紫外可见光谱扫描,再用HPLC法测定粗提液中番茄红素质量浓度.丙酮粗提液300～600 nm区间的紫外可见吸收光谱图呈一宽峰,而乙酸乙酯和正己烷粗提液的紫外可见吸收光谱与番茄红素标准品相似.HPLC法证明丙酮粗提液中确实含有番茄红素.用紫外分光光度法和HPLC法测定同一丙酮粗提液中番茄红素质量浓度分别为4.76mg/mL和2.19 mg/mL.番茄红素丙酮粗提液的紫外吸收光谱图呈一宽峰并非受浸提方法的影响,可能与浸提溶剂有关,因此番茄红素的丙酮粗提液不能用紫外分光光度法进行质量浓度测定.     

CIMS工程中软件集成的设计

研究了基于PDM进行CAD、CAPP、CAM和工程技术信息的集成 ,以及与MRPⅡ管理信息的集成 ,以形成企业CIMS系统 介绍了CIMS系统的总体结构 ,描述了各个子系统之间的关系和数据传递 PDM是信息集成的核心 ,文中介绍了PDM的设计以及与CAx软件之间的关系 为了实现生产自动化 ,使CAM与数控机床直接连接 ,建立了一对多的接口 还介绍了进行信息集成的一些关键技术和解决方法     

产学结合在港口工程技术专业人才培养中的实践

产学结合是高职教育发展的必由之路,校企结合的办学方式是行之有效的高职人才培养方法。港口工程技术专业以产学结合为宗旨,以就业为导向,使专业建设和人才培养水平迈上一个新的发展台阶。