lys1-d缺陷型标记介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合

传统构建毕赤酵母质粒多拷贝菌株的方法不仅操作复杂、成本高,而且难以获得理想中的高拷贝菌株.近来,一种利用leu2-d缺陷型标记直接筛选毕赤酵母多拷贝克隆的方法显示出很大的便利.本研究发现,使用一个lys1-d缺陷型标记能更加高效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合.首先构建一个携带lys1-d和EGFP(enhanced green fluorescent protein)报告基因的整合载体,然后将载体转化至敲除了内源lys1基因的毕赤酵母中,最后分别检测了转化子内EGFP含量和质粒拷贝数.结果显示,所有转化子整合的质粒拷贝数均处于19～168之间;并且转化子内质粒拷贝数越高,其胞内表达的EGFP产量也越高.这一系统为构建毕赤酵母超高拷贝质粒整合菌株增添了有效的工具.     

rDNA介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用

根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增特定的2．2kb rDNA片段,并以此替换酿酒酵母(Saccharomyces cereristae)整合载体YIp5的URA3片段;在此基础上,引入G418抗性基因KanMX和酵母磷酸甘油激酶(phosphoglycerale kinase,PGK)组成型强启动子和终止子序列(PGKp-t),构建适合酿酒酵母工业菌株高拷贝整合表达载体pYMIKP,以细菌木糖异构酶(xylose isomerase,XI)基因xy/A为目标基因,通过载体pYMIKP引入到酵母工业菌株NAN-27中,酵母转化子在非选择培养条件下,连续生长50世代质粒稳定性为99．72％,目标基因高拷贝重组菌的木糖异构酶比酶活是对照菌株的67．2倍,达到0．672U／mg蛋白,实现了外源基因在酿酒酵母工业菌株中的稳定高效表达。     

解脂耶氏酵母异源合成类胡萝卜素的研究进展

类胡萝卜素是一类具有红色或橙黄色的四萜类化合物,具有强抗氧化能力,被广泛地应用于食品、医药、饲料等行业,传统的生产方法是化学合成、植物提取。解脂耶氏酵母是一种安全的产油酵母,具有充足的类胡萝卜素积累前体和良好的胞内疏水性环境,是类胡萝卜素异源生物合成的理想宿主。近年来,国内外普遍采取合成生物学的策略,在解脂耶氏酵母中构建并优化类胡萝卜素的合成途径,实现其异源高水平合成。综述了近年来解脂耶氏酵母异源合成类胡萝卜素的研究进展,并对未来的研究进行了展望。     

优化合成有机磷水解酶opd p基因在毕赤酵母中的表达

拟验证通过密码子优化有机磷水解酶(opd)基因,和生物砖方法构建opd多拷贝载体,以提高在毕赤酵母中的表达量.将原始的opd基因依照毕赤酵母偏爱密码子设计合成新的有机磷水解酶基因,并在C端添加了6个His-Tag融合蛋白标签.所合成的opd p基因全长1 149 bp(base pair).基因克隆入p HBM905BDM毕赤酵母表达型质粒,成功构建重组表达质粒p HBM905BDM-opd p,以及多拷贝表达质粒p HBM905BDM-opd p-2C,p HBM905BDM-opd p-3C,p HBM905BDMopd p-4C,转化毕赤酵母感受态细胞GS115.实验结果表明,经甲醇诱导后,在AOX1(乙醇氧化酶基因)启动子调控下,获得OPD P蛋白分泌表达,Western Blot检测4个转化的菌株中都表达了目的蛋白,且两拷贝表达量较一拷贝有提高,达到0.2 U/m L.但是随着拷贝数的进一步增加表达量呈现下降的趋势.     

解脂耶氏酵母yPPI基因的克隆与功能研究

用硫酸二甲酯诱变解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）野生型菌株，获得了不能在油酸作惟一碳源的培养基上生长的突变株.通过功能互补突变株在含油酸的培养基上的生长，从解脂耶氏酵母基因组文库中克隆了一个基因.同源性比较发现，该基因产物与广泛分布于各种生物体中的亲环素类的肽基脯氨酰顺反异构酶（PPI）有较高的同源性，因此将该基因命名为yPPI.电子显微镜下观察发现，yPPI基因突变株发生了一系列明显的结构变化，在其细胞核的周围出现了许多膜系结构，且细胞内没有过氧化物酶体.免疫荧光分析表明，yPPI基因突变细胞的过氧化物酶体基质蛋白能够正常地合成，但它们不是定位于过氧化物酶体内，而是均匀地分布于细胞质中.这些结果表明yPPI的存在与过氧化物体的形成和过氧化物酶体基质蛋白的正确定位有着密切的关系，证明了亲环素类肽基脯氨酰顺反异构酶对过氧化物酶体的生物合成作用.     

噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crtB,编码八氢番茄红素合成酶。利用PCR技术扩增出crtB基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtB。重组质粒转化大肠杆菌,构建工程菌株。经IPTG诱导,工程菌高效表达了重组八氢番茄红素合成酶,表达量占菌体总蛋白的40%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子树脂亲和层析、Superdex 75凝胶层析柱纯化,得到了电泳纯的重组八氢番茄红素合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为35 kDa,pI值为7.3。     

ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷贝整合表达载体的构建

利用PCR技术,以酿酒酵母S288c的基因组DNA为模板,扩增酿酒酵母肌醇-1-磷酸合成酶基因(ScINO1)包含1 602bp的开放读码框,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定,测序结果与GenBank上已登录的ScINO1序列完全一致.对PUG6载体进行改造,构建了rDNA介导的多拷贝整合表达载体pURH,并将ScINO1基因连入载体pURH,获得ScINO1基因超表达载体pURIH.为下一步的微生物发酵法产肌醇和获得能够耐高乙醇的酵母工程菌株的研究奠定基础.     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

短小芽孢杆菌C-9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C-9中克隆得到葡聚糖内切酶基因,该基因包含1980 bp核苷酸,编码559个氨基酸,其N端有一个预测的29个氨基酸的信号肽序列;以YIp5质粒为骨架,构建rDNA介导的多拷贝整合载体,实现葡聚糖内切酶在酿酒酵母中的高效、稳定表达。与对照菌株相比,含有葡聚糖内切酶基因的重组酿酒酵母可以在以羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基上生长。     

结合利用pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的多拷贝载体并在毕赤酵母中表达

结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的可线性化多拷贝表达载体,并转化毕赤酵母表达目的蛋白.首先将目的蛋白基因构建到组成型表达载体pGAPZαA中,然后依据载体自身特性,用同尾酶BglⅡ和Bam HⅠ切取其表达盒并连接到甲醇诱导型载体pPICZαA中的Bam HⅠ位点处,经多次重复后获得目的蛋白多拷贝表达载体,线性化后电转化毕赤酵母表达目的蛋白.灵芝免疫调节蛋白LZ8是一个已成功在毕赤酵母中表达的蛋白,作为检验该方法的样本其基因被首先构建到载体pGAPZαA中得到质粒pGAPZαA-LZ8,切取其表达盒构建到载体pPICZαA中,经过4次重复得到了多拷贝表达载体pPICZαA-[GAPZαA-LZ8]4,然后利用pPICZαA特有的限制性内切酶位点SacⅠ进行线性化,最终电转化到毕赤酵母GS115中进行组成型表达蛋白LZ8,其表达量达到pGAPZαA-LZ8转化菌株表达量的2~3倍.经检验,结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA可以构建目的蛋白的多拷贝表达载体,并且可以对载体进行线性化而不影响转化酵母时的转化效率.     

利用复积分计算实积分

在物理学研究中,需要计算一些特殊实积分,这些积分按实积分计算比较麻烦,有些甚至不可能,但化为复积分,运用柯西积分定理及留数定理来计算简捷方便.给出了用复积分计算物理学中狄利克雷积分、菲涅耳积分、欧拉积分及开普勒积分等几种特殊实积分的方法.     

关于复合求积公式余项的研究

借助积分相关理论,给出了数值积分中复合梯形公式和复合Simpson求积公式余项误差事后估计式的严格证明及其余项表达式中的导数因子f″(ηn),f″(η2n),f(4)(ηn)和f(4)(η2n)在n充分大时的变化情况.为处理求积公式余项关系式提供了新的方法.     

A general standard of WebGIS integration

Nowadays, existing WebGIS applications are isolated from each other. It is meaningful and challenging to integrate these existing applications to reduce resource loss. In this paper, the concept of WebGIS integration service is presented and its classification including width integration and depth integration is brought out. According to width integration and depth integration, a general standard of WebGIS integration is proposed. The merits of WebGIS integration service are analyzed with the representative examples from both of the two classes mentioned above.      

双向微积-连续分部积分研究

应用微积恒等变形规律，提出双向微积一连续分部积分公式，可以快速的解决一类高次多项式与指数函数、三角函数乘积的积分问题．     

基于整合理论数字图书馆建设问题研究

近年来,整合理论正被广泛的应用于各个领域。在数字图书馆方面,随着信息及网络技术的发展,存在着大量异构系统及庞杂的资源,因而整合理论的深入应用也成必然。本文先简单的从概念、发展、分类、模式及体系结构几方面介绍整合理论;再结合数字图书馆建设的实际,分析目前存在的主要问题并提出相应的解决意见。     

中原城市群9市旅游产业与信息产业融合度评价

建立衡量信息产业与旅游产业发展水平的评价指标体系,利用熵权法确定指标权重,运用综合评价法构建旅游产业与信息产业融合度模型.以中原城市群9市为例,对2012—2016年9市旅游产业与信息产业发展水平及两者融合情况进行测度.研究结果表明:从整体来看,中原城市群9市旅游产业与信息产业的发展呈现出持续向好的发展态势,两产业协调发展能力逐年提升,但评价阶段内整体融合水平较低,大部分城市呈现信息产业发展滞后的状态.     

图书馆数字资源整合研究

介绍了数字资源整合系统,分析了数字资源整合的3个层面及其整合模式。     

经济一体化与金融一体化对货币政策的影响

随着金融市场的开放与国际资本流动的加快，经济一体化、金融一体化发展将对货币政策产生巨大影响，包括时货币政策目标的影响，对货币政策传导机制的影响，对货币政策效能的影响，对货币政策中介目标的影响，对货币政策操作方法的影响，以及对国际货币体系构建中的货币政策独立性的影响。     

对称性在定积分及二重积分计算中的应用

运用数学分析中的积分总结了对称性在积分运算中的应用,给出了对称性在定积分、二重积分运算中的有关定理以及应用;充分体现了对称性在积分运算中带来的方便,达到了简化积分运算的目的。这一点对于数学理论的研究及积分运算的解答都有重要意义。     

EAI在广电行业的应用

本文从广电行业信息系统应用现状出发,介绍了企业应用集成的概念、体系结构和集成层次,探讨了利用企业应用集成技术从各个层面实现整合的方案框架及实施应注意的问题,阐述了广电行业基于企业应用集成技术的整合方案以及带来的利益和好处.