中国河南西峡恐龙蛋化石中18SrDNA部分片段的克隆及序列分析

本文从河南省西峡晚白垩世的一枚保存方式特殊的恐龙蛋化石中提取ＤＮＡ，经过￣３２Ｐ同位素标记和电泳分析，发现在蛋内腔的絮状物样品中确有ＤＮＡ片段存在。它们的大小约在１０００ｂｐ至几十ｂｐ之间，大多数片段在４００ｂｐ以下。用１８ＳｒＤＮＡ特异引物，以上述ＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，经电泳分析得到约２００ｂｐ的ＰＣＲ产物。经过连接、转化到大肠杆菌，最终筛选出６个阳性克隆。测序分析和同源性比较发现这６个克隆的序列与两栖类、爬行类、鸟类及人类等的１８ＳｒＤＮＡ具有很高的同源性，但是与原核生物没有发现同源性，而且没有检索出与该基因完全相同的已知序列。     

瓢虫干标本基因组DNA的提取及RAPD分析

实验对保存多年的瓢虫干标本进行了基因组 ＤＮＡ提取和 ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增。结果显示 ＤＮＡ分子的提取与保存年代长短无直接关系;ＲＡＰＤ－ＰＣＲ增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,分子量大小约为 １９８４ｂｐ～６３０ｂｐ;不同种瓢虫的 ＤＮＡ用同一引物,扩增片段是多态表现,同一种瓢虫的干标本保存时间虽不同,但扩增产物中均具有相同的ＤＮＡ片段。     

盐藻磷酸甘油脱氢酶基因cDNA文库的构建

采用Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０载体构建了盐藻ｃＤＮＡ文库，文库大小为１０＾６／ｍＬ插入片段平均长度大于１ｋｂ。根据果蝇，兔，鼠编码其３－磷酸甘油脱氢酶基因的辅酶ＮＡＤ的结合功能区保守序列设计一对引物，大小分别为２１ｂｐ和１８ｂｐ。ＰＣＲ扩增得到与果蝇相同的２９０ｂｐ特异扩增片段，以该片段为探针，采用缺口平移系统标记原位杂交，从盐藻ｃＤＮＡ文库中获得３６个３－磷酸甘油脱氢酶基因的阳性克隆。     

绵羊β—乳球蛋白基因调空序的分离,克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｂｐ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间。     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

抑癌基因FHIT的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法，从人脑ｃＤＮＡ库中克隆ＦＨＩＴ基因，扩增得到５５３ｂｐ片段克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ载体，测定了其ＤＮＡ序列。该序列包括ＦＨＩＴ ｃＤＮＡ编码区全部４４４ｂｐ，以及５‘端５２ｂｐ和３’端５７ｂｐ非编码区序列。编程区有二处位点发生突变，第９２位密码子中的Ｃ突变成Ｇ，是同义突变，不导致氨基酸改变；     

用PCR法检测人巨细胞病毒DNA

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）法检测患者尿液中人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ．结果表明，自行设计合成的引物位于ＨＣＭＶ基因组早期蛋白基因区，经ＰＣＲ仪扩增一段长４３０ｂｐ的特异序列片段，对正常人基因组ＤＮＡ或其它疱疹病毒ＤＮＡ无交叉反应．此法可检测出少至１０－１６ｇ（０．１ｆｇ）的病毒ＤＮＡ．通过对３５份尿液标本的检测，比较ＰＣＲ法和组织培养法的检测结果完全一致     

用PCR扩增和克隆鸡贫血病毒衣壳蛋白VP2基因

接种鸡贫血病毒（ＣＡＶ）Ｃｕｘ－１毒株于ＭＤＣＣ－ＲＰ１细胞中,并用经狄高辛标记的ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ１基因克隆ＤＮＡ作为探针在斑点杂交中检测和比较了各代细胞中ＣＡＶ ＤＮＡ水平。通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从ＣＡＶ ＤＮＡ水平较高的ＭＤＣＣ－ＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ２基因片段约６５０ｂｐ的编码序列,将该ＰＣＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点克隆到ｐＵＣ１９质粒载体中,     

水稻花药特异表达基因启动子的扩增及克隆

采用ＤＮＡ聚合酶链式反应扩增技术，以水稻黄化苗总ＤＮＡ为模板成功地扩增到水稻花约特异表达基因扇动２子Ｏｓｇ６Ｂ的７７０ｂｐ和９６０ｂｐ两个片段Ｏｓｇ６Ｂａ和Ｏｓｇ６Ｂｂ。并将其克隆到ｐＵＣ１８上形成完整的Ｏｓｇ６Ｂ，这为通过基因工程方法进行水稻杂种优势利用奠定了基础。     

胜加端PCR技术改造hIGF—1cDNA

用ＤＮＡ合成仪合成了分别带有ＰｓＩ位点和ＳａｉＩ位点及张终止密码子的２个用于扩增ｈＩＤＧＦ１ｃＤＮＡ的ＰＣＲ引物，利用合成的引物，７００ｂｐ长的ｈＩＧＦ－Ｄ１ｃＤＮＡ模板和Ｔａｑ聚合酶进行ＰＣＲ扩增。     

PCR和原杂交技术检测鼻咽癌石蜡组织中HHV-6DNA

为了解人疱疹病毒６型（ＨＨＶ－６）与鼻咽癌（ＮＰＣ）的可能关系，检测了ＮＰＣ发生不同阶段的石蜡组织中ＨＨＶ－６ＤＮＡ的存在情况。方法：采用ＰＣＲ、斑点杂交和原位杂交技术，共检测了４２例鼻咽癌石蜡组织、２１例鼻咽癌前病变石蜡组织和２７例正常鼻咽石蜡组织ＨＨＶ－６ＤＮＡ的存在情况。结果：通过ＰＣＲ扩增，在４２例ＮＰＣ组织中检出１３例存在ＨＨＶ－６ＤＮＡ，占３１％；２１例鼻咽癌前病变组织中１例阳性（４７％），而２７例正常鼻咽组织中无一例阳性。斑点杂交的结果表明ＰＣＲ扩增是ＨＨＶ－６特异的。原位杂交发现，在１３例ＰＣＲＨＨＶ－６阳性的ＮＰＣ组织中１１例ＨＨＶ－６ＤＮＡ阳性。ＨＨＶ－６ＤＮＡ主要分布于癌巢的肿瘤细胞核内，少数亦可见于癌旁的异型细胞，但在淋巴细胞及正常上皮细胞内未发现阳性信号。结论：本实验用分子生物学技术首次证明，在中国ＮＰＣ患者的鼻咽石蜡组织中存在ＨＨＶ－６。ＨＨＶ－６与ＮＰ相关，并有可能在ＮＰＣ的癌变过程中起一定的作用     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶原基因的初步研究

从桂北五步蛇毒腺中抽提蛇毒总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一试管内进行）扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,并进行电泳检测,可见３条特异的ＤＮＡ条带,分别约为１．５Ｋｂ、１．３Ｋｂ和８００ｂｐ,利用平端连接的方法将其中的８００ｂｐＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定。     

用PCR法构建乳腺特异性表达非乳蛋白基因的研究

将ＰＣＲ法分别从绵羊和人血基因组ＤＮＡ中扩增出的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５＇端调控区８９８ｂｐ的片段和人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ的片段连接。连接片段插入ｐＵＣ１９ ＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ位点，构建成ｐＢＬＧ－ｈＣＤ１４质粒。该质粒经ＫｐｎＩ及ＣｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ酶切、ＰＣＲ法扩增ＢＬＧ和ｈＣＤ１４分析后，进一步用＾３２Ｐ－ＢＬＧ探针杂交确证。用Ｅｃ     

猪兰尼定受体基因的PCR—RFLPS检测

从血样中提取２０种头猪的基因组ＤＮＡ，利用合成的特异性引物，进行ＰＣＲ扩增，得到了含兰尼定受体基因第１８４３碱基的６５９ｂｐＤＮＡ片段，利用ＨｈａⅠ酶切和电泳检测了兰尼定受体基因的变异，结果表明，在２０头猪中，基因型Ｎｎ的杂合子猪４头，占２０％基因型为ＮＮ的兰尼定受体基因正常猪１６头，占８０％，未检测到兰尼定受体基因突变纯合子，作者的研究证实利用ＰＣＲ－ＲＦＬＰＳ技术检测兰尼定受体基因型具有快速，     

通用引物PCR方法检测生殖道HPV

目的：通用引物ＰＣＲ技术检测生殖道人乳头瘤病毒。方法：根据国外献报道的基因序列选出一对寡核苷酸引物，其扩增片断为４５０ｂｐ。结果：在４５０ｂｐ处出现ＤＮＡ扩增带为阳性，用于临床标本的检测，其阳性率为３０％（２９／９６）。结论：通用引物ＰＣＲ技术检测生殖道ＨＰＶ－ＤＮＡ快速，敏感，可靠。     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

中国鹅5个品种随机扩增多态DNA(RAPD)分析

目的 用随机扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）技术分析中国鹅的５个品种一皖西白鹅、太湖鹅、浙江白鹅、四川白鹅和狮头鹅的随机扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）。方法 从３４个１０－寡核苷酸随机引物中筛选出的１４个引物对每一品种的总基因组ＤＮＡ进行了单引物ＰＣＲ扩增,结果 ５个品种共扩增出１７４个ＤＮＡ片段,其中４８个（占２７．６％）在５个品种间表现多态性,根据扩增ＤＮＡ片段的异同计算了各品种间的遗传距离指皖西白鹅和     

竞争性RT-PCR检测哮喘患者IL-8表达水平

利用反向ＰＣＲ法,缺失人ＩＬ－８ｃＤＮＡ内部ｂｐ６邓列,构建得到ＩＬ－８突变内标分子。用已知最的该内标分子,通过竞争性ＲＴ－ＰＣＲ法,检测支气管哮喘患者外周血ＩＬ－８基因的表达情况,发现患者Ｌ－８ｍＲＮＡ的表达水平明显高于正常人对照组,这一结果初步表明,利用竞争性ＲＴ－ＰＣＲ技术对支气管哮喘患者进行早期基因诊断,具有一定的可行性。     

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型症状的病犬肠溶物经ＳＤＳ－酚裂解法提取总ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,通过人工合成的两条２０ｍｅｒ引物进行ＰＣＲ扩增,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白ＶＰ２基因中间１／３区段,ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳,试验结果表明：用ＰＣＲ扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性,应用该方法检测的２７份病犬肠溶物样品块获得了预计长度的ＤＮＡ片段（５３１ｂｐ）,而健康犬的肠溶物样品ＰＣＲ结果为     

分离与克隆中国人TPO基因片段及序列分析

应用ＲＴＰＣＲ技术从中国人胎肝细胞中分离出１个５６６ｂｐ大小的基因片段,经过克隆、限制性内切酶鉴定和序列分析证实为ＴＰＯ的ｃＤＮＡ片段．与ＧｅｎＢａｎｋ中发表的人ＴＰＯｍＲＮＡ的序列比较同源性在８２％～９９％之间,仅有２个碱基不相同,在１７５位密码子（５２３～５２５位的碱基）分别是ＣＧＧ和ＣＡＡ,即精氨酸（Ｒ）的位置上,中国人是谷胺酰氨（Ｇ）．而与测得的韩国人序列比较,在相应位置的氨基酸是相同的