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1.
人胰岛素原类似物(B-Arg-Arg-A)基因的构建和表达 总被引:3,自引:0,他引:3
用聚合酶链反应(PCR)法将C肽为6个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成C肽仅为2个精氨酸残基的胰岛素原类似物(BArg-Arg-A)基因,即把pUC18BC'A改建为pUC18BR2A。再将pUC18BR2A与pJG105重组为表达质粒pJG107,使B-Arg-Arg-A与pJG105编码的一种多肽构成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的58%。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。 相似文献
2.
6个氨基酸小C肽人胰岛素原类似物基因的构建和表达 总被引:1,自引:1,他引:1
用片段置换法,从在C肽两端具有酶切位点的双突人胰岛素原因中,将C肽基因替换成含Arg-Arg-Gly-Ser-Arg-Lys6个氨基酸小C肽基因。将这个小C肽岛素原类似物基因重组到具有Tac启动子的质粒中,并与部分牛凝乳酶原基因融合,在E.coli中得到了高效表达。表达的BC'A融合蛋白占菌体总蛋白的16%。表达产物以包含体形式存在,经CNBr裂解及磺酸,再经复性后,具有对胰岛素的放射免疫活性。 相似文献
3.
去B链羧端三肽人胰岛素原的基因构建和表达 总被引:1,自引:0,他引:1
用改进的寡苷酸诱导 突变法将人胰岛素原基因(BCA)删除编码B链羧端三肽的碱基片段,得到去B链羧端三肽胰岛素原的基因(B^-3CA)。为了便于表达产物的蛋白质后加工,又用PCR的方法在B链N端起始Met与Phe密码子之间增加了编码Lys的3个碱基,得到改造后基因LB^-3CA,将LB^-3CA克隆到表达质粒pBV220上,在大肠杆菌系统中热诱导表达,表达率为12%。表达产物经蛋白质后加工,得到的去 相似文献
4.
袁汉英 《复旦学报(自然科学版)》1997,36(5):489-494
采用大肠杆菌密码子,用化学法分别合成人胰岛素21个氨基酸的A链,30个氨基酸的B链,并在基因的5端引入甲硫氨酸密码子,尾部加入终止密码,两端加入限制性内切酶,A链为83个核苷酸,B链为110个核苷酸,经纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接反应后,分别克隆了人胰岛素A、B链基因,然后选用PL启动子,构建了以牛生长前134个氨基酸的大片段基因,分别与人胰岛素A链、B链基因的融合基因的融合基因的表达质粒PLW 相似文献
5.
通过PCR方法扩增了人胰岛素(HI)基因1.34kb的DNA片段并克隆于pUC18的SmaⅠ位点内。经DNA序列分析表明,该片段为HI基因的氨基酸编码区及3'端调控区序列。同时,应用PCR方法对牛α-乳白蛋白(BαLA)基因进行了扩增,得到了0.84kbDNA扩增片段。将其克隆于去除了EcoRI位点的pUC18SmaI位点内,经内切酶分析和DNA测序证明该片段是BαLA基因5'调控区序列。EcoR 相似文献
6.
将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。 相似文献
7.
从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出白细胞介素15(IL-15)基因.构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒(pET28c(+)-IL-15)含有IL-15基因.经Western blot鉴定证实为IL-15,并实现了在大肠杆菌中的高效表达.表达产物占菌体总蛋白的32%,从而为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定了基础. 相似文献
8.
采用定点突变技术,将人胰岛素原基因编码框中A11位氨基酸残基与A12位氨基酸残基进行了互换,构建了[CysA11Ser,SerA12Cys]人胰岛素原突变基因.在大肠杆菌原核表达系统中对突变体基因进行了表达,并对表达产物进行了变复性研究及初步的分离纯化,获得了具有稳定结构的突变体蛋白质,探讨了突变体A链链内二硫键的形成状况,为进一步深入揭示A链链内二硫键的角色与功能打下了基础. 相似文献
9.
双突变的胰岛素原基因在E.coli温度诱导表达体系中直接高密度发酵表达,表达产物形成的包含体经变复性处理及Sephadex G50纯化后,再由胰酶及羧肽酶B联合酶切,FPLC Mono Q纯化,最终得到B链羧端去三肽胰岛素(B28-B30)(DTRI)和去四肽(B27-B30)(DTI)胰岛素的纯品。应用悬滴气相扩散法在含丙酮的柠檬酸钠缓冲体系中培养出可供X射线衍射用DTRI单晶,空间群为P212 相似文献
10.
人胰岛素原DNA疫苗的构建与鉴定 总被引:1,自引:1,他引:1
构建1型糖尿病关键自身抗原胰岛素原(Proinsulin)的DNA疫苗,并在体外对其表达产物进行鉴定。从人胰腺cDNA库用半巢式PCR扩增出编码Proinsulin的cDNA,克隆入载体PGEM-T中,再将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组载体pcDNA3.1( )/Proinsulin,测序后在真核细胞COS-7中进行体外短暂表达,Western印迹法对其表达产物进行鉴定。结果克隆的人Proinsulin基因,测序表明其cDNA序列与Genbank公布的序列基本相同,仅在第63位氨基酸(C肽区)有一CAG(Glu)→CGG(Arg)的突变,Western免疫印迹法证实DNA疫苗在COS-7细胞中有效地获得了表达。结果说明运用基因克隆方法构建的Proinsulin DNA疫苗,在真核细胞内能有效地表达Proinsulin重组抗原。该疫苗的构建成功,为1型糖尿病的免疫干预提供了实验基础。 相似文献
11.
为了检测改造后的CryIA(C)基因在植物中的表达,将其构建成表达载体并采用膛杆力介导的方法导入蕃茄,通过对转基因番茄植株的PCR,Southem和Northem blot分析,证实外源CryIA(c)基可整合到番茄基因组中,并能顺利表达,为该基因在其它农作物上的提供了依据。 相似文献
12.
以人免疫缺陷病毒2(HIV-2)的原病毒基因组为模板,通过套式PCR扩增得到了HIV2的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体pGEX-5X-1,获得了重组表达质粒pGEX36-ENV.IPTG对重组表达菌株诱导后,SDS-PAGE结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生。 相似文献
13.
构建两种胰岛自身抗原谷氨酸脱羧酶( glutamic acid decarboxylase, GAD) 65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗,并检测其在体外COS-7细胞中的表达。PCR方法从GAD65质粒中扩增出GAD190-385和GAD490-570两个片段的cDNA,overlap法再分别与信号肽基因进行拼接,将拼接后的融合基因SGAD190-515和SGAD490-570分别与胰岛素B链基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCFA.1中。重组质粒经酶切和测序鉴定后,脂质体体外转染COS-7细胞,Western blot方法检测目的基因在该细胞中的表达。结果表明核酸序列测定克隆的融合基因和胰岛素B链基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western blot显示转染了DNA疫苗的COS-7细胞中均可检测两个目的基因的表达。两种GAD65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗均成功构建,为自身免疫糖尿病的免疫干预研究奠定了实验基础。 相似文献
14.
依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础. 相似文献
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通过比较几个已知HSP70的cDNA顺序,用PCGENE软件中的PCRPLAN程序设计出一对简并引物,然后从水稻(广陆矮4号)总DNA中扩增出HSP70的基因片段并将其克隆到pBLUESCRIPT载体中。在完成了对克隆的序列测定之后,用PCGENE中有关程序对其进行同源分析,并对其他已知的HSP70作了一些分类及分子进化方面的探讨。 相似文献
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目的 构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7 DNA疫苗质粒.方法 从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV11-E7基因,将E7基因经双酶切后定向克隆到pcDNA3.1( )中,测序鉴定.结果从病变组织中扩增出了全长HPV11-E7基因,并正向插入载体pcDNA3.1( )中,经酶切和测序鉴定无误.结论 HPV11-E7 DNA疫苗质粒构建成功,为今后进行防治尖锐湿疣的动物实验和临床实验奠定了基础. 相似文献
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利用先前构建的cDNA文库和RACE方法,克隆了松墨天牛原肌球蛋白基因的cDNA全长,该序列长1 203 bp,命名为MaTm(GenBank登录号:KM099072),其中开放阅读框长852 bp,编码283个氨基酸.MaTm的氨基酸序列与赤拟谷盗 (Tribolium castaneum)相似性最高,为97%,与家蚕相似性 (Bombyx mori)为94%.松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上.用 RT-qPCR 分析了MaTm的相对表达量,结果显示:蛹和幼虫的表达量低于成虫;成虫足和头的表达量高于对照;在幼虫各组织中均有表达,且差异显著(p0.05),其中在体壁的表达量最高. 相似文献
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将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His+Muts 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定. 相似文献