灵芝酸性组分的提取分离及抑菌活性研究

探讨灵芝中酸性组分的提取、分离及分析方法,并研究其抑菌活性.结果表明,灵芝醇提物经碱处理分离出总酸性组分的产率为0.8%～1.1%,当以n-C6H14/CH2Cl2/CHCl3/MeOH(体积比为4.0∶3.0∶2.5∶0.5)为展开剂时,薄层色谱仅显示Rf值为0.54～0.12的6条主要带(S1～S6);抑菌圈法测定结果显示:该灵芝的酸性组分为25mg/mL时对金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)均有明显抑制作用;粗灵芝酸性组分经硅胶柱层析纯化后,CHCl3/MeOH(V∶V=98∶2)洗脱部分(S1)对大肠杆菌有明显抑制作用,而对金黄色葡萄球菌呈明显抑制作用的则集中在CHCl3/MeOH(V∶V=50∶50)洗脱部分(S5,S6).上述灵芝酸性组分的提取与分离方法简便易行,成分与产率稳定可控,且有明显抗菌活性,在抗菌制剂应用方面有潜在的药用价值.     

放线菌酮诱导SV40增强子的启动子活性的研究

在蛋白质合成抑制放线菌酮（CHX）诱导下,pCAT－E质粒中SV40增强子能启动CAT基因的表达,在很短的时间（5min)和很低的CHX质量浓度（30ng/mL）条件下,CHX即能诱导pCAT－E中SV40增强子的启动子活性,为了研究CHX诱导的pCAT-E质粒中SV40增强子的启动子活性是否与位置有关,构建了两个组体：pCAT-Bas-Enh(-)和pCAT-Bas-Enh( ),改变了SV40增强了序列与载体中CAT报告基因的相对位置,用重组质粒转染CHO细胞并用CHX处理,检测不到CAT活性,说明pCAT－E质粒中CHX所诱导的SV40增强子启动子活性受SV40增强子位置的影响。     

重金属污染土壤中泛基因组的提取及其细菌种类的免培养法分析

采用玻璃粉吸附法提取重金属污染土壤的泛基因组,利用细菌16S rDNA保守区段B2/B3为引物,经PCR扩增获得包含V8和V9两个高变区的大小为1050 bp的产物.将回收纯化的PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞,经抗生素抗性和蓝白斑筛选,并提取质粒作酶切分析,随机挑取3个阳性克隆菌进行序列测定,结果表明3个序列所代表的均是芽孢杆菌属(Bacillus)细菌,而且均是与Bacillus flexus亲缘关系非常接近的细菌.     

4×35s增强子的克隆及其功能验证

用PCR扩增法获得含4×35s增强子的DNA片段,酶切后克隆到质粒pREP-GFP中,得到4×35s增强子插入方向相反的两种表达质粒pREPen1和pREPen2,并进行了测序确认.这两种表达质粒和pREP-GFP同时转化亮氨酸缺陷型裂殖酵母.荧光显微镜观察表明,pREP-GFPen1和pREP-GFPen2转化的酵母细胞,比pREP-GFP转化的酵母细胞所发的绿色荧光强8~10倍,体积大2~5倍.使用流式细胞仪和Lowry方法分别测定三种细胞平均荧光强度和蛋白量,测量结果表明:2×104细胞的平均荧光强度分别为1 800 U,1 800 U和200 U;2×104细胞的GFP含量分别为200μg,200μg和25μg.这一结果证明4×35s增强子增强了gfpgene的表达水平,所克隆的4×35s增强子具有正常的功能.     

短小芽孢杆菌(Bacillus p umilus )糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组 DNA 为模板,利用简并PCR 技术扩增到基因(GT‐A )全长序列.该序列全长1287 bp 、编码423个氨基酸,分子量约为49.2 KD .经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据 GT‐A 基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA‐pet28a ,并在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50 kD 的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

抗艾滋病病毒蛋白CVNH在大肠杆菌中表达条件的优化

CVNH(Cyanovirin-N homology)蛋白家族是具有抗HIV活性的蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)的同源物。在前期研究中,已首次获得水蕨Ceratopteris thalictroides CVNH基因的全长序列,构建了pET32a-CtCVNH的原核表达载体。以此为基础,对CVNH在大肠杆菌Rosetta 2(DE3)中的表达条件进行优化。分别探讨了最佳培养基类型及成分、培养基初始pH、诱导时机、诱导剂浓度及诱导时间。优化后的诱导条件是:含24 g.L-1酵母提取物和72 g.L-1胰蛋白胨的TB培养基、培养基初始pH为8.0、菌液A600nm为0.6时加入1.6 g.L-1乳糖诱导6 h。CVNH蛋白的表达量较优化前提高了1.9倍。这为进一步开展CVNH的药物研制和开发奠定基础。     

球面稳定同伦群的一族新元素g_0(b_1)~2■_s

证明了在经典A dam s谱序列中,当p≥11,3≤s≤p-3时,g0(b1)2∈E x t6,A 2p2q p q 2q(H*V(2),Zp)在A dam s谱序列中收敛到π2p2q p q 2q-6V(2)的非零元,g0(b1)2s~γ∈E x t6A s,(s 2)p2q sp q sq (s-3)(Zp,Zp)在A dam s谱序列中收敛到(πs 2)p2q sp q sq-9S的非零元.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用简并PCR技术扩增到基因(GT-A)全长序列.该序列全长1 287bp、编码423个氨基酸,分子量约为49.2KD.经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据GT-A基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA-pet28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50kD的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

1q42.3染色质区域一个前列腺癌特异性超级增强子样元件通过染色质相互作用促进细胞迁移

前列腺癌在全球男性中发病率居于前列,遗传因素是影响前列腺癌发生发展的主要因素. 研究报道1号染色体长臂42 区3 带至43 区(1q42.3-43)存在一个潜在的前列腺癌易感染色体座位,但这个易感座位与肿瘤关联的分子机制迄今未得到确认. 增强子是能够改变染色质活化状态的DNA 序列,通过精准调控基因时空表达从而决定细胞身份命运. 通过ChIP-seq 发现1q42.3 染色质区域存在一个前列腺癌特异性超级增强子样元件;利用CRISPR/Cas9 系统敲除该区段后发现细胞迁移能力明显降低,并利用RNA-seq 筛选出多个差异表达的基因;通过Hi-C 鉴定出与该超级增强子样元件相互作用的染色质区段;最后将RNA-seq 和Hi-C 进行综合分析预测出该超级增强子样元件直接调控的基因.     

大鼠谷胱甘肽S-转移酶P1基因增强子及其反式作用因子的研究

探讨大鼠谷胱甘肽S-转移酶P1基因上游增强子元件及作用于其上特异性结合蛋白与该基因在癌细胞中高表达的关系,用荧光素酶报告系统在HeLa及CBRH7919细胞中确定了增强子元件Ⅰ(GPEⅠ)及增强子元件Ⅱ(GPEⅡ)的活性,并将GPEⅡ的增强子活性部位定位于其上游84bp的GPEⅡ-1区域内．分析对比不同细胞中结合于GPEⅠ核心序列(cGPEⅠ)、GPEⅡ-1上特异性核结合蛋白,发现HeLa,CBRH7919细胞中存在的cGPEⅠ特异性结合蛋白及GPEⅡ-1特异性的64ku结合蛋白在正常大鼠肝细胞中则不存在．因此,上述反式作用因子可能与GPEⅠ,GPEⅡ的增强子活性及该基因在癌细胞中高表达密切相关．     

2株甲型肝炎病毒(L8 株、H2株)蛋白酶2A在大肠杆菌中的表达

首次把生长特性有显著差异的 2株甲型肝病毒 (L8株、H2 株 )的蛋白酶 2A基因分别用基因工程技术克隆到大肠杆菌表达载体 pGEX -KG上 ,重组质粒转化至大肠杆菌 (E .coliBL - 2 1和DH5α)中 ,表达的结果显示 :2株甲型肝病毒的蛋白酶 2A均得以表达 ;表达量占菌体总蛋白 2 0 %以上 .为进一步纯化该蛋白酶、研究其生物学功能和与真核细胞代谢的关系奠定了基础 .     

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体，PCR合成ompT引导序列，插入该载体多克隆位点上游，构建了分泌型原核表达载体pTO-OT．将2个外源基因克隆至pTO-OT，2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达．表达产量在25％～34％之间．Western blot分析证实了融合蛋白可被大肠杆菌信号肽酶有效地切割。并具有良好的免疫学活性．对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的表达稳定性，显示了其在基因工程中的应用价值．     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv - 2E3和ScFV - 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET - 2 0b ,pET - 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒PUC -2E3和pUC - 1A8,pET2 0b - 2E3和pET2 0b - 1A8,pET2 8a - 2E3和pET2 8a - 1A8以及pHOG - 2E3和pHOG - 1A8,然后分别转化至大肠杆菌中 ,提取质粒 ,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析 ,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段 ,说明已成功构建了 8个含ScFv基因的表达质粒     

三株微枝形杆菌属菌株的分离鉴定及其抗马铃薯晚疫病菌活性分析

针对分离自内蒙古自治区巴彦淖尔地区的3株形态一致的菌株BM-9、BM-12和BM-15进行鉴定并分析其抗马铃薯晚疫病菌活性。形态鉴定结果表明,三个菌株菌落形态呈透明或半透明状,颜色为乳白色或肉粉色,表面凸起,边缘光滑,出现完整菌膜,在涂有大肠杆菌的培养基上培养6 d左右可观察到棕色颗粒状物质。细胞呈短杆状,(0.425~0.51)μm×(0.425~1.7)μm。16S r DNA序列分析表明,这三个菌株的16S r DNA序列同微枝形杆菌属(microvirga sp.)的序列相似度均达到98%以上。结合形态特征及16S r DNA序列分析结果,菌株BM-9、BM-12和BM-15属于微枝形杆菌属。三个菌株均有明显的溶大肠杆菌活性及不同程度的抗马铃薯晚疫病菌活性。其中菌株BM-9抗马铃薯晚疫病菌活性最强,平板对峙抑制距离为15 mm,菌丝的生长抑制率达到60%。本研究进一步加深了对微枝形杆菌属的了解,为未来微枝形杆菌属针对性的研究提供了一定的参考。     

球面稳定同伦群的一族新元素

证明了在经典Adams谱序列中,当p≥11,3≤s≤p-3时,g0(b1)2∈Ext6,2p2q+pq+2qA(H*V(2),Zp)在Adams谱序列中收敛到π2p2q+pq+2q-6V(2)的非零元,g0(b1)2s∈Ext6+s,(s+2)p2q+spq+sq+(s-3)A(Zp,Zp)在Adams谱序列中收敛到π(s+2)p2q+spq+sq-9S的非零元.     

梭鱼和鲻鱼线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段的比较分析

运用PCR技术,扩增了梭鱼和鲻鱼线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段,并比较分析了其种间的序列差异。获得16S rRNA基因的540～560 bp碱基序列,出现26个碱基的插入与缺失位点;获得COⅠ基因的602～604 bp碱基序列,出现2个插入缺失位点;16S rRNA和COⅠ基因的序列中G平均含量最低,且(A+T)含量高于(G+C)含量,与其他鱼类中的16S rRNA和COⅠ基因片段研究结果相一致。在16S rRNA基因片段中,梭鱼出现1种单倍型,鲻鱼为2种单倍型;在COⅠ基因片段中,梭鱼样品中检测到3个单倍型,鲻鱼样品中检测到5个单倍型。以Takifugu poecilonotus为外群,构建的NJ系统发育树,基于16S rRNA和COⅠ基因序列获得的NJ系统树基本一致,鲻鱼和梭鱼种内个体分别聚为一支,显示16S rRNA和COⅠ基因适合于梭鱼和鲻鱼的物种鉴定。     

基于多粒度网络预测增强子-启动子相互作用

准确识别增强子-启动子相互作用（EPIs）对疾病来源追踪和发展基因疗法有重要意义。现有预测方法缺乏对序列不同粒度信息的关注,提取增强子、启动子序列包含的不同粒度特征有助于从多层级分析EPIs。因此,提出EPIs预测模型EPI-PBGA(Parallel BiGRU Attention Network),分别通过卷积子网络和双层双向门循环单元（BiGRU）注意子网络提取序列的细粒度、粗糙粒度特征。基于EPIs普遍存在的细胞特异性,在不同细胞系进行粒度选择,选定最优粗糙粒度,同时通过双层BiGRU注意网络提取元件子序列中存在的多种关联特征。实验结果表明,EPI-PBGA在6个基准数据集表现出较好性能,有效预测EPIs。     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将2种抗A型产气英膜梭菌α毒素单链抗体（ScFv）基因ScFv－2E3和ScFV-1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET-20b,pET-28a和pHOG21中,构建了重组质粒PUC2E3和pUC-1A8,pET20b-2E3和pET20b-1A9,pET28a-2E3和pET28a-1A8以及pHOG-2E3和pHOG-1A8,然后分别转化至大肠杆菌中,提取质粒,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段,说明已成功构建了8个含ScFv基因的表达质粒。     

利用增强子样DNA片段提高几丁酶基因的表达

将来源于环状芽孢杆菌（Bacillus cirulans)C-2中增强子样DNA片段插入质粒pCHT1的几丁酶基因5’－端，构建成重组质粒pCHTX^ 和pCHTX^-。将含pCHT1,pCHTX^ 和pCHTX^-质粒的大肠杆菌转化子分别点种在几丁质平板上，不同菌株产生了不同大小的水解圈。利用比色法测定不同菌种的几丁酶活性发现，在大肠杆菌中，该片段的插入可促进几丁酶基因的表达，而在枯草杆菌中则没有明显的增强作用。