依折麦布的酶法合成

以价廉易得的氟苯和戊二酸为原料,经傅-克反应、酰胺化、酮的还原、偶联和环合等数步反应合成依折麦布,总收率为7.5%.其中,用KRED238全细胞酮还原酶直接还原化合物5的羰基获得了具有S构型的羟基化合物中间体6,该步反应的收率为95%,(S)-羟基de值95.68%,还原反应的立体选择性高.该结果证实了生物催化技术应用于依折麦布合成中的可行性,为依折麦布绿色不对称合成工艺的发展提供了新的思路.     

高迁移率族蛋白1对脐静脉内皮细胞迁移及相关蛋白表达的影响

【目的】组织工程中微循环的建立在生物材料植入中发挥重要作用,其中血管内皮细胞迁移是快速血管生成的主要影响因素。组织和器官损伤后常引发炎症反应,高迁移率族蛋白1(HMGB1)是炎症反应的起始因子,但对内皮细胞迁移的影响尚不清楚。【方法】体外提取和培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),并进行细胞表型鉴定;构建培养液中含有HMGB1的浓度梯度,通过CCK-8、划痕实验和Transwell小室实验检测HUVECs的增殖能力和迁移能力,采用RT-qPCR和Western Blot检测细胞内细胞增殖因子和迁移因子基因和蛋白的表达情况。【结果】不同浓度HMGB1对HUVECs的增殖能力无显著影响,但对细胞迁移能力有浓度依赖性,随着HMGB1浓度增加,细胞的迁移能力增强。FGF-2表达随HMGB1浓度增加表达上调;高浓度HMGB1处理HUVECs后,VEGFA表达明显下降。【结论】HMGB1可通过FGF-2促进HUVECs迁移,为今后HMGB1对内皮细胞迁移能力的影响研究提供依据。     

依折麦布与羧甲基-β-环糊精包合物的制备表征及增溶研究

依折麦布(ezetimibe, EZT)是一种选择性肠道胆固醇抑制剂,然而水溶性差限制了其应用.包合物的制备可以有效提高药物的水溶性,通过饱和水溶液法制备了EZT的羧甲基-β-环糊精包合物,并通过冷冻干燥法得到最终的粉末状包合物.核磁共振、扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱和X-射线粉末衍射等结果证实了包合物的成功制备,相溶解度法表明羧甲基-β-环糊精与EZT结合比为1∶1,二者的结合常数为187 M^-1,增溶倍数为412倍.溶出实验结果表明包合物的制备明显提高了药物的体外溶出度.     

细胞自噬与高迁移率族蛋白B-1(HMGB1)介导肿瘤耐药的研究进展

恶性肿瘤可通过多种细胞机制,产生对抗癌药物和放疗的抗性,即所谓耐药现象.细胞自噬是肿瘤细胞耐药的一个重要原因.高迁移率族蛋白B-1(HMGB1)是高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白,在DNA结构、基因转录、基因重组、DNA损伤修复以及细胞存活等方面发挥重要的调控作用;HMGB1在细胞内的功能,与其氧化还原状态和细胞定位息...     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACE PCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因(HMG1)mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸.不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明:在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性(99%)高于同父本团头鲂的同源性(97%);三倍体鲫鲂与父母本同源性(95%)低于亲本之间的同源性(98%);在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性(100%)高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性(97%).结果表明:远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础.生物信息学分析表明:HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾.这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生"蛋白-DNA"的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成.另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMG1原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制.     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACEPCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因（HMGj）mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸．不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明：在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性（99％）高于同父本团头鲂的同源性（97%）;三倍体鲫鲂与父母本同源性（95％）低于亲本之间的同源性（98％）;在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性（100％）高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性（97％）．结果表明：远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础．生物信息学分析表明：HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾．这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生“蛋白-DNA”的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成．另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMGl原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制．     

人血管生成素样蛋白4在毕赤氏酵母中的表达及其生物活性的初步研究

将编码人的血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)的cDNA克隆至分泌表达载体pPIC9k上,在Pichia Pastoris酵母宿主菌SMD1168中获得分泌表达;用MTT方法检测的细胞生长抑制实验结果表明,发酵液中分泌表达的重组蛋白ANGPTL4对人脐静脉内皮细胞的生长具有一定的抑制作用．     

中枢神经系统来源的HMGB1表达模式和释放特征

目的:阐明生理病理状态下,中枢神经系统(CNS)来源的高迁移率族蛋白1(HMGB1)细胞定位、亚细胞定位和释放特征.方法:使用Western Blot和细胞免疫荧光双标记法检测HMGB1在细胞株(U87, BV2和N2a)和原代星形胶质细胞、神经元的表达模式和释放特征.用PTX和/或ATP处理培养细胞,Western Blot检测浓缩上清中HMGB1蛋白表达,台盼蓝拒染法检测细胞的生存率.结果:HMGB1定位于U87、BV2、N2a,原代星形胶质细胞和神经元的细胞核,位于目的条带25 KDa位置. PTX和/或ATP能诱导U87和BV2主动分泌HMGB1,N2a细胞被动释放HMGB1.结论:生理状态下,星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元细胞核表达HMGB1,属于HMGB1来源,HMGB1具有CNS释放特征.     

小凹蛋白-1和钙受体在人的脐静脉内皮细胞的表达

为探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中小凹蛋白-1与细胞外钙受体表达及定位,为进一步功能研究提供理论依据,采用Western-blot和Rt-PCR及免疫荧光技术检测HUVEC中小凹蛋白-1与细胞外钙受体mRNA和蛋白表达及定位.结果显示:(1)形态学观察和免疫细胞化学法测Ⅷ因子抗原,95%以上的细胞呈阳性着色,证实细胞为HUVEC.(2)RT-PCR检测到HUVEC中459bp和260bpmRNA表达,Western-blot测到HUVEC中22KD和150-160KD蛋白表达.(3)免疫荧光检测到小凹蛋白-1与细胞外钙受体定位于人脐静脉内皮细胞膜.由此可知,人的HUVEC中有小凹蛋白-1与细胞外钙受体表达,两者是否共定位及其功能有待进一步研究.     

局灶性脑梗死后缺氧诱导因子-1α基因的治疗作用及机制研究

目的:构建携带缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,探索HIF-1α在成年大鼠局灶性脑梗死中的治疗作用及可能机制.方法:应用腺病毒表达系统AdEasy System构建携带缺氧诱导因子-1α和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒(Ad-HIF-1α)并行PCR鉴定.建立大鼠线栓法大脑中动脉缺血再灌注模型.分为Ad-HIF-1α、腺病毒空载体(Ad)、生理盐水(NS)三组;将Ad-HIF-1α、Ad和NS分别注射到模型鼠梗死侧侧脑室.通过大体脑解剖和Nissl染色检测模型是否成功,原位杂交检测脑组织HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、SDF-1αmRNA的表达差异,三组大鼠神经功能缺失评分和2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色评价Ad-HIF-1α对脑缺血的治疗效果.结果:大体脑解剖标本和Nissl染色均证明大脑中动脉缺血再灌注模型成功建立.经氯化铯梯度离心法纯化后Ad-HIF-1α的滴度为8.2×108pfu/ml,PCR鉴定表明Ad-HIF-1α构建成功.三组大鼠脑梗死后HIF-1αmRNA、VEGFmRNA和SDF-1αmRNA的表达均有明显增加,且均于72h达最高峰.Ad-HIF-1α组HIF-1αmRNA、VEGFmRNA和SDF-1αmRNA在72h的表达与Ad和NS组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而Ad和NS组比较则差异无统计学意义(P＞0.05).Ad-HIF-1α治疗组72 hAd-HIF-1α治疗组神经功能缺失评分分别为1.6±0.7和0.9±0.6,与Ad组(分别为2.9±0.6和3.2±0.6)和NS组(分别为3.0±0.7和3.2±0.8)比较差异均有统计学意义(P＜0.05).72 h时脑组织TTC染色显示Ad-HIF-1α治疗组梗死体积为81.2 mm3±1.4mm3,与Ad组(173.9 mm3±1.3mm3)和NS组(171.7mm3±6.2mm3)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:HIF-1α基因在成年大鼠局灶性脑梗死中具有积极的治疗作用,其作用机制不仅是通过上调抗缺氧基因或脑保护基因如VEGF的表达使缺氧的组织细胞保持氧稳定及耐受低氧状态,而且还通过上调修复基因如SDF-1α的表达达到修复受损的神经组织和重建神经系统的作用.     

儿茶素对溶血卵磷脂胆碱所致细胞损伤的保护作用

作者以体外培养的小牛主动脉内皮细胞为材料,研究了溶血卵磷脂胆碱（LPC）和氧自由基（OFR）对血管内皮细胞（VEC）的损伤,及儿茶素对VEC的保护。结果显示：当VEC与LPC（6ug/ml）或黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶（X／XO）（10umol/L 200umol/L）共孵育24小时时,表现为细胞内乳酸脱氢酶（LDH）泄漏量增多,细胞内过氧化脂质丙二醛（MDA）含量升高,细胞生长减缓,存活率下降;当加入不同浓度的儿茶素后则可明显抑制LDH的泄量,降低MDA含量,细胞生长正常,存活率提高。表明LPC与X／XO对VEC有损伤作用,而儿茶素则能通过抗氧化途径抵抗LPC与X／XO至VEC的损伤。     

两种内皮细胞分泌血管紧张素Ⅱ的差异

为进一步了解血管内皮细胞 (VEC)在代谢特征上的异质性 ,加深对VEC生物学特性的认识 ,文中应用平行平板流动腔装置 ,将人胚肾小球血管内皮细胞 (HGVEC)和牛肺动脉内皮细胞 (BPAEC)两种不同的EC在同样的剪切流环境中剪切作用 2 4h ,利用放射免疫法检测循环液中血管紧张素II(AngII)分泌量。结果表明 ,HGVEC的AngII平均分泌率 ( 7.5 4± 0 .2 7)pg (cm2 ·h)显著高于BPAEC( 6 .0 8± 0 .11)pg (cm2 ·h) ,且HGVEC的AngII平均分泌率随剪切时间的增加而减少 ,在各时点间的变异相对较大 ;而BPAEC的AngII平均分泌率在各时点的分泌率较为稳定 ,变幅较小。表明这两种内皮细胞在AngII分泌特性上存在异质性。     

可溶性血管内皮生长因子受体1在IgAN的研究进展

可溶性血管内皮生长因子受体1（soluble fms-like tyrosine kinase 1,sFlt-1）是已证实的内皮细胞损伤的分子标志物.sFlt-1在循环中结合VEGF（血管内皮生长因子）而调节其功能,拮抗VEGF的营养功能而导致内皮细胞损伤.有研究发现在慢性肾脏疾病（CKD ）患者中sFlt-1有明显升高,过量的sFlt-1与CKD内皮功能障碍有关.而IgAN是我国最常见的CKD,目前国内外缺乏关于sFlt-1在IgAN中的相关研究.sFlt-1与IgAN临床病理之间相关性的研究是一个全新的研究方向.研究sFlt-1与CKD特别是发病率很高的IgAN的相关性并应用其研究成果,对IgAN的诊断、治疗和判断预后是一个新的思路.     

反义核酸技术对人血管内皮细胞的改造作用

为降低在血栓形成早期血管内皮细胞分泌的血管性血友病因子(vWF)对凝血级联反应的触发效应,利用反义核酸技术构建降低vWF表达量的血管内皮细胞.人工合成vWF部分反义核酸(pvWF),构建重组的真核表达载体pcDNA3.1( )/pvWF.测序正确后用脂质体介导的方法转染血管内皮细胞,硫酸新霉素加压筛选后扩大培养转基因细胞,RT-PCR法检测转基因细胞中vWF mRNA的表达水平.结果表明,构建的vWF反义核酸真核表达载体能有效抑制细胞中vWF mRNA的表达,为新型抗凝血材料的研究提供一种基因改造的内皮细胞.     

低氧对复合培养的肺微血管内皮细胞生长的作用

研究低氧对复合培养的肺微血管内皮细胞（LMVEC）生长的作用。用低氧气体（3％O2）处理复合培养的LMVEC细胞;流式细胞仪检测细胞的周期。在常氧或低氧条件下,LMVEC复合培养组G1期和S期细胞增多,G2／M期细胞显减少（P＜0.01,分别与单独培养组比较）;低氧单独培养组G1期细胞显减少,G2／M期细胞增多（P＜0.01,与常氧单独培养组比较）;低氧复合培养组G1期和DNA合成期（S期）细胞增多,G2／M期细胞减少（P＜0.01,与常氧复合培养组比较）。可见,低氧能促进单独或复合培养的LMVEC的增殖,复合培养的LMVEC比单独培养组增殖降低。     

血管内皮生长因子在低氧运动中的效应及一氧化氮的介导作用

血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞特异性的有丝分裂原,具有促进内皮细胞增生、迁移和增加血管通透性等多种重要生物学作用。研究表明,VEGF在发挥这些生物学作用的过程中一氧化氮(NO)起着必不可少的作用。随着高原训练理论研究的不断深入,低氧运动条件下VEGF对机体机能影响的研究倍受关注,其中VEGF和NO关系的探讨有助于低氧运动状况下对VEGF作用机制的进一步阐述。     

树鼩胸主动脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的 体外分离、培养树鼩(Tupaia belangeri)胸主动脉血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs),并对培养细胞进行初步鉴定, 为新型实验动物树鼩的应用研究提供体外模型。方法 无菌取幼龄树鼩胸主动脉,采用组织块培养法和胰蛋白酶、胶原酶连续消化法分别进行树鼩胸主动脉血管内皮细胞分离,经完全培养液培养,倒置显微镜观察细胞形态,并用抗Ⅷ因子抗体进行荧光染色鉴定细胞。结果 经组织块培养法分离培养的血管内皮细胞,3 d有细胞贴壁,7 d后细胞从组织块中大量长出,15 d汇合为单层;酶消化法所得细胞12 h即贴壁,3～7 d生长较快,12 d汇合成单层,镜下观察发现细胞呈典型的铺路石状;两种方法分离所得原代细胞经体外培养传代,6代内,细胞生长均良好;利用血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子进行免疫荧光鉴定后确定为阳性。结论 本研究采用简便的方法成功分离到了树鼩胸主动脉血管内皮细胞,为血管内皮细胞相关研究提供了实验模型。     

血管组织工程内皮细胞分离培养新方法

建立一种简单高效的血管组织工程内皮细胞分离培养方法.无菌分离大鼠主动脉,剪成约5 mm×2 mm的组织块,内膜朝下平铺于含Ⅰ型胶原酶的细胞培养皿中消化30 min,收集内皮细胞;其后,取出组织块继续内膜朝下置于另一培养皿中贴壁培养,直至细胞爬出并融合成单层.观察细胞形态,并分别对两种方式获得的传至第5代的细胞进行Ⅷ因子...     

葛根黄酮对糖基化终产物致细胞损伤的修复

研究了糖基化终产物（AGEs）对血管内皮细胞（VEC）的作用,以及葛根黄酮对AGEs致VEC损伤的修复.以体外培养的新生小牛胸主动脉VEC为材料,检测了AGEs (4 g/L)作用于VEC 24 h后,细胞内一氧化氮（NO^-₂/ NO^-₃）、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽（GSH）和脂褐素（LPF）含量的变化;细胞乳酸脱氢酶（LDH）的泄漏量;AGEs对细胞生长增殖的影响,及细胞形态和超微结构的变化.结果显示AGEs (4g/L)可使细胞增殖率、LDH、MDA及LPF含量显著升高（P<0.01）,NO^-₂/ NO^-₃和GSH含量显著降低(P<0.01).细胞形态收缩变形,胞内出现脂滴和空泡.同时加入葛根黄酮,可使以上指标及细胞形态均接近或恢复到正常水平.因此,葛根黄酮可作为防治糖尿病血管并发症的外源性氧自由基清除剂.     

食管鳞状细胞癌中VEGF和nm23表达和临床意义

 探讨VEGF和nm23基因产物表达与食管鳞状细胞癌（ESCC）临床病理指标及预后的关系,应用免疫组织化学Elivision法对食管癌组织和癌旁正常食管粘膜组织中VEGF蛋白和nm23蛋白进行检测。结果表明,90例食管癌组织中VEGF蛋白56例高表达,19例低表达,15例不表达,阳性率为83.33%,在28例正常黏膜组织中6例低表达,阳性率为21.42%,两者比较具有统计学意义（P<0.05）;90例食管癌组织中nm23蛋白24例高表达,23例低表达,43例不表达,阳性率为52.22%,在28例正常食管黏膜组织中23例表达,5例不表达,阳性率为82.14%,两者比较具有统计学意义（P<0.05）。无食管癌旁淋巴结转移组的nm23阳性表达率64%（32/50）较有转移组的表达率37.5%（15/40）高,有显著性差异（P<0.05）。VEGF和nm23的表达与分化程度、浸润深度无关（P>0.05）。由此表明,VEGF阳性伴nm23阴性表达的患者发生淋巴结转移的可能性大,VEGF和nm23在食管癌中的表达与食管癌的发生、发展、浸润、转移和预后密切相关,可作为临床预测浸润转移和估计预后的重要参考指标。