H2O2介导的NO合成参与乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭

利用药理学实验、激光共聚焦显微技术结合遗传学手段,证明光下乙烯利可诱导拟南芥叶片气孔关闭,且具有时间和剂量效应. 乙烯利能够明显增加气孔保卫细胞和叶片的H2O2和NO水平,且H2O2和NO清除剂均明显抑制乙烯利诱导的拟南芥叶片气孔关闭.硝酸还原酶(NR)、NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶的抑制剂可不同程度抑制乙烯利的作用. 乙烯利亦可明显诱导Atnoal突变体叶片气孔关闭及NO的积累,但对nial,nia2突变体没有明显影响.清除H2O2可减弱乙烯利对NO含量和NR活性的诱导效应,说明H2O2和NO均参与乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭,且NO(主要由NR途径合成)可能位于H2O2下游参与调控这一信号通路.     

NO,H2O2介导根系渗透胁迫和脱落酸诱导的气孔关闭

运用表皮实验和激光扫描共聚焦显微镜技术对NO和H2O2在根系渗透胁迫和外源脱落酸（ABA）处理诱导蚕豆气孔关闭中的作用及其相互关系进行了研究．结果表明，渗透胁迫及外源ABA处理既促进保卫细胞内源NO和H2O2形成，也诱导气孔关闭；外源H2O2和SNP可促进气孔关闭，也分别诱导保卫细胞NO和H2O2产生．还对根系渗透胁迫诱导蚕豆气孔关闭中ABA、NO和H2O2的关系进行了讨论，认为渗透胁迫可能通过ABA诱导NO和H2O2产生，促进气孔关闭且NO和H2O2之间存在相互作用．     

ABA和H2 O2在NaCl诱导的气孔关闭中的作用

以拟南芥野生型（wt）和ABA合成缺失突变体（aba3）为材料，采用表皮生物分析法研究了NaCl胁迫条件下，ABA和H2O2在气孔关闭中的作用。结果表明：100mmol/L的NaCl可有效诱导wt气孔关闭，而对aba3的气孔运动无明显影响；10^-2mmol/L的H2O2处理或100mmol/L的NaCl与10^-2mmol/L ABA共处理可有效诱导wt与aba3的气孔关闭，且幅度类似；H2O2的性清除剂CAT可部分逆转NaCl处理及NaCl与ABA共处理引起的气孔关闭，因此推测，NaCl胁迫条件下，植物保卫细胞内ABA浓度升高，诱导H2O2的产生，进而诱导了气孔关闭。     

铜胺氧化酶在乙烯诱导蚕豆气孔关闭中的作用

研究了铜胺氧化酶(CuAO)及其催化产物过氧化氢(H2O2)在乙烯利诱导蚕豆气孔关闭中的作用.乙烯释放化合物2-氯乙基磷酸(乙烯利)激活了非质体CuAO活性、提高了保卫细胞H2O2产生并诱导气孔关闭,乙烯利的上述效应被CuAO的两种不可逆抑制剂氨基胍(AG)和2-溴乙胺(BEA)抑制.在几种CuAO催化产物中,只有H2O2能阻止AG或BEA抑制乙烯利诱导气孔关闭.CuAO的主要底物腐胺(Put)也不抑制乙烯利诱导气孔关闭.研究结果表明,CuAO催化产生的H2O2参与了乙烯诱导的蚕豆气孔关闭.     

高浓度CO_2诱导气孔关闭中H_2O_2和NO的关系及其酶源

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型、NADPH氧化酶突变体和硝酸还原酶(NR)突变体为材料,借助气孔试验和激光扫描共聚焦显微镜技术,对H_2O_2和NO的酶源以及H_2O_2和NO的关系进行了研究。结果表明:高浓度CO_2关闭了野生型的气孔,该效应在AtrbohF突变体中部分缺失、在AtrbohD/F中完全缺失,但在AtrbohD中未见缺失;同时,高浓度CO_2诱导野生型保卫细胞H_2O_2产生的效应在AtrbohD和AtrbohF中部分降低,但在AtrbohD/F中完全缺失。这些结果显示,AtrbohD和AtrbohF催化产生的H_2O_2参与高浓度CO_2诱导气孔关闭。高浓度CO_2能诱导野生型保卫细胞NO合成和气孔关闭,该效应在Nia1-2和Nia2-5/Nia1-2突变体中完全缺失,但在Nia2-1中未缺失,显示Nia1来源的NO参与高浓度CO_2诱导气孔关闭。高浓度CO_2未诱导AtrbohF和AtrbohD/F保卫细胞NO合成,但诱导Nia1-2和Nia2-5/Nia1-2保卫细胞H_2O_2产生。NO供体SNP显著恢复AtrbohF和AtrbohD/F突变体气孔对高浓度CO_2反应的缺失,但H_2O_2未恢复Nia1-2和Nia2-5/Nia1-2气孔对高浓度CO_2反应的缺失。所以,高浓度CO_2诱导气孔关闭中NO合成依赖于H_2O_2产生。     

油菜素内酯诱导蚕豆气孔关闭与过氧化氢和一氧化氮的关系

研究了油菜素内酯(BR)对蚕豆气孔运动的效应及其与过氧化氢和一氧化氮的关系。结果表明,BR能显著诱导气孔关闭,其最适处理浓度和时间分别为5μmol/L和3h。H2O2清除剂抗坏血酸和过氧化氢酶、NO清除剂c-PTIO和血红蛋白、过氧化氢产生酶NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘和NO产生酶一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME均显著抑制BR诱导的气孔关闭,显示NADPH氧化酶催化产生的H2O2和NOS催化产生的NO参与BR诱导气孔关闭。BR有显著抑制ABA诱导气孔关闭的效应。     

外源NO诱导的拟南芥保卫细胞胞质pH升高先于气孔关闭

以pH敏感的绿色荧光蛋白拟南芥转基因植物为材料,研究了保卫细胞胞质pH变化与外源一氧化氮（nitric oxide,NO）诱导气孔关闭的关系,结果发现,与对照相比,100μmol／LNO供体硝普钠（sodium nitroprusside,SNP）可显著增加胞质的pH（增加约0．29个pH单位）,并诱导气孔关闭．NO清除剂c—PTIO、弱酸丁酸以及质膜H^＋-ATP酶的抑制剂钒酸钠均有效抑制了SNP诱导的保卫细胞胞质碱化和气孔关闭,而弱碱苄胺的作用与丁酸相反,说明保卫细胞胞质碱化介导了外源NO诱导的气孔关闭．另外,钙离子的螯合剂EGTA、钙调蛋白激酶抑制剂ML-7、钙调素的拮抗剂W7以及激酶抑制剂K-252a均可明显抑制外源NO诱导的胞质pH升高和气孔关闭,说明钙离子及磷酸化在NO诱导的保卫细胞胞质碱化和气孔关闭中发挥重要作用．     

气孔运动调控中过氧化氢和一氧化氮信号途径的交叉作用

用NO荧光指示剂DAF-2DA测定了H 2 O 2 对蚕豆和鸭跖草气孔保卫细胞NO的影响;以蚕豆幼苗为材料研究了H 2 O 2 和NO在调控气孔运动中的相互关系.结果表明,H 2 O 2 能够诱导保卫细胞胞质NO的形成,其诱导作用可以被2-苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(PTIO)所清除和N G -氮-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)所阻断.推测保卫细胞中可能存在一氧化氮合酶(NOS)类似物.H 2 O 2 主要是通过NOS途径诱导产生NO.在10～100μmol/L范围内,NO的供体硝普钠(SNP)和H 2 O 2 都可诱导气孔关闭,并具明显的浓度效应.H 2 O 2 清除剂过氧化氢酶(CAT)能够完全抵消NO的诱导气孔关闭作用;H 2 O 2 合成抑制剂二苯基碘(DPI)可部分减弱NO诱导的气孔关闭.NO合酶抑制剂L-NAME和NO的清除剂与H 2 O 2 共处理时,H 2 O 2 诱导气孔关闭的作用被大大减弱.结果说明,在调控气孔运动中H 2 O 2 和NO具有相互依赖性,H 2 O 2 和NO信号分子具有信号自身放大功能,共同参与了对气孔运动的调控.     

一氧化氮可能参与细胞外钙调素诱导蚕豆气孔关闭的过程

细胞外钙调素(CaM)被发现能够调节蚕豆及拟南芥气孔运动,而且G蛋白、H_2O_2及Ca~(2 )参与这一过程．从接受刺激到引起气孔关闭保卫细胞要经历复杂的信号转导,因此细胞外CaM调控气孔运动的信号转导途径还需要深入探讨．研究中以蚕豆下表皮条为材料,用表皮条生物分析和荧光显微技术研究了一氧化氮(NO)在细胞外CaM促进气孔关闭过程中的作用．结果表明:细胞外CaM能诱导保卫细胞内NO升高,一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N~G-氮-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)和NO清除剂2-苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(PTIO)抑制了这一过程,而硝酸还原酶(NR)抑制剂NaN_3则没有抑制作用;L-NAME和PTIO也抑制细胞外CaM诱导的气孔关闭过程,而NaN_3不能抑制这一过程．说明细胞外CaM主要通过NOS途径诱导NO合成,从而诱导气孔关闭．质膜Ca~(2 )通道抑制剂及Ca~(2 )螯合剂处理实验结果表明,细胞外CaM对保卫细胞内NO的诱导过程依赖Ca~(2 )内流．文中结果为NO参与细胞外CaM调节气孔运动的过程提供了直接证据．     

eATP通过H2O2参与H2S对拟南芥气孔运动和保卫细胞K+流的调节（英文）

硫化氢(H2S)和通过ABC转运体转运至胞外形成的胞外ATP(eA TP)均参与对气孔运动的调控,但尚不清楚eA TP在H2S诱导气孔关闭中的作用机制.本研究显示,ABC转运体抑制剂和质膜嘌呤受体抑制剂能够抑制H2S诱导的气孔关闭和所引起的保卫细胞中H2O2水平的升高;但H2S不能引起Atmrp4、Atmrp5以及Atmrp4/5中eA TP的积累和保卫细胞中H2O2水平的升高;H2S亦不能引起Atmrp4/5保卫细胞原生质体K+外流.据此推论:H2S可通过eA TP调控H2O2,进而调节气孔保卫细胞钾离子通道诱导气孔关闭.     

茉莉酸甲酯诱导气孔关闭的信号转导机制初探

用不同浓度的茉莉酸甲酯处理拟南芥叶片的下表皮，发现10^-5mol/L的茉莉酸酯是诱导气孔关闭的最适浓度，而且还进一步证明了在茉莉酸甲酯诱导气孔关闭过程中，H2O2和Ca2 有可能是诱导气孔关闭转导链之中的中间环节。     

NO在水杨酸诱导葱莲果实上气孔运动中的作用

以葱莲外果皮为材料,研究了NO在水杨酸(salicylic acid,SA)诱导葱莲外果皮上气孔运动的作用.结果表明:在一定浓度范围内,单独施用不同浓度的NO和SA均可诱导葱莲外果皮上气孔不同程度的关闭,并且浓度越大,诱导气孔关闭的效应越明显;NO和SA共同施用所诱导气孔关闭的效应大于其单独施用效应;NO的清除剂血红蛋白(hemoglobin,Hb)和硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)的抑制剂叠氮化钠(NaN3)能明显削弱SA诱导葱莲外果皮气孔关闭的效应.因此推论,在诱导葱莲果实上气孔运动过程中,NO和SA之间具有协同效应,并且SA通过NR途径诱导产生NO,进而诱导气孔关闭.     

壳梭孢素促进蚕豆气孔开放与保卫细胞H2O2的关系

研究了壳梭孢素(FC)诱导蚕豆气孔开放与保卫细胞过氧化氢(H2O2)水平的关系.结果证明,FC、H2O2清除剂抗坏血酸(ASA)和H2O2合成抑制剂二苯基碘(DPI)均能于暗中诱导气孔开放.另外,FC和ASA不仅阻止外源H2O2诱导气孔关闭,而且促进暗诱导已关闭气孔重新开放,但DPI无此效应.将上述结果联系起来考虑,表明FC通过清除降低保卫细胞内源H2O2水平进而促进气孔开放.     

GPX3参与了H2O2对保卫细胞质膜钾通道的调控

通过表皮条生物分析、失水率测定及膜片钳实验研究谷氨酸过氧化物酶3(GPX3)能够调节保卫细胞质膜钾通道活性,并因此来介导H2O2诱导的拟南芥气孔关闭过程.与野生型Col-0相比,gpx3缺失突变在气孔开度和细胞失水方面均有较大差异.全细胞膜片钳模式下,1mmol/L的H2O2处理使野生型保卫细胞质膜钾离子通道外向电流从50pA左右激增到240pA左右,而gpx3的电流则变化不大.单通道电流的进一步分析表明gpx3不能像野生型一样对1mmol/L的H2O2处理产生明显反应,野生型与突变体的单通道电流差距高达10倍以上.据此推断GPX3是通过特异地调节外向钾通道来介导H2O2的信号传递.     

Ca2+在H2O2促进蚕豆气孔关闭过程中的作用

利用表皮生物分析法，通过表皮条缓冲液中加CaCl2研究了Ca＾2＋在H2O2促进蚕豆气孔关闭过程中的作用．研究发现在不同浓度的H2O2溶液中加入0．05mol/L和0．005mol/L CaCl2均能加强H2O2对蚕豆气孔关闭的促进作用，H2O2和Ca^2 浓度越高，气孔开度减小越明显．推测在H2O2促进蚕豆气孔关闭过程中，保卫细胞质中Ca^2 浓度升高时的来源可能是质外体中的Ca^2＋．     

外源过氧化氢对蚕豆气孔运动的影响

运用外源过氧化氢(H2O2)处理、光镜观察的方法研究了H2O2对蚕豆气孔运动的影响．结果表明，H2O2诱导气孔关闭的最适浓度和最佳时间分别为100μmol／L和3h．H2O2促进气孔关闭的作用可被抗坏血酸和过氧化氢酶(CAT)逆转．还就内源H2O2在光、暗调控的气孔运动中的作用进行了讨论．     

硫化氢参与镉诱导拟南芥气孔的关闭

以拟南芥为实验材料,利用分光光度法、显微观测法及药理学实验,研究了镉(Cd~(2+))、硫化氢(H2S)和脱落酸(ABA)处理对拟南芥野生型(wild type,WT)、abi5和lcd气孔运动的影响,以及H_2S合成酶L-半胱氨酸脱巯基酶(LCD)的活性和体内H2S含量的变化。结果表明:光照条件下,随着Cd~(2+)浓度的增加,野生型拟南芥气孔孔径逐渐减小,LCD的活性及内源H_2S含量依次升高。200μmol/L的CdCl_2可以减小abi5的气孔开度,且50μmol/L的H_2S也可以减小abi5和WT的气孔开度,而ABA并不能减小abi5的气孔开度,说明Cd~(2+)诱导的气孔关闭主要依赖H2S信号。实验进一步验证了这种现象:与WT相比,200μmol/L的CdCl_2对LCD缺失突变体(lcd)气孔开度的影响不大,加入H2S的供体NaHS后,lcd气孔关闭。研究发现,Cd~(2+)可通过增强LCD的活性,促进L-半胱氨酸分解生成H_2S,进而诱导拟南芥气孔关闭     

NADPH氧化酶NtrbohD参与烟草悬浮细胞ABA诱导的H2O2快速产生过程

研究了烟草BY-2悬浮细胞在脱落酸（ABA）诱导下产生过氧化氢（H2O2）的机制,发现ABA能够显著诱导H2O2快速产生,且H2O2主要是由超氧化物歧化酶催化超氧阴离子产生的．ABA处理可导致烟草悬浮细胞质膜NADPH氧化酶活性以时间依赖的方式快速增加,其增加的幅度和时间与ABA诱导H2O2积累一致,而且,这些增加的效应能够被NADPH氧化酶抑制剂碘二苯和咪唑显著抑制,说明质膜NADPH氧化酶参与烟草悬浮细胞H2O2快速积累过程．另外,用RT-PCR和蛋白印迹技术分析了烟草质膜NADPH氧化酶基因NtrbohD的表达水平,发现该基因在mRNA和蛋白水平的表达受ABA上调,表明NtrbohD参与烟草悬浮细胞ABA诱导H2O2快速产生过程．结果说明,ABA能够诱导悬浮细胞通过NADPH氧化酶快速产生活性氧,提示NAD-PH氧化酶和H2O2可能是植物细胞中ABA信号转导途径的重要成分。     

拟南芥RING finger结构域ABRv1基因的功能初步研究

拟南芥ABscisic acid responsive RING-v protein 1基因（ABRv1）编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶。为了分析ABRv1的基因功能,我们首先构建了高表达载体pBI121- ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1。通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T –DNA插入突变体abrv1。对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,检测其萌发率、气孔关闭情况进行,发现ABA处理后突变体的萌发率降低,过表达株系萌发率升高;突变体株系气孔几乎未关闭,过表达株系气孔关闭非常明显。以上结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用,为深入分析该基因的功能打下基础。     

Na^＋、Ca^2＋、H2O2诱导黄瓜叶片细胞凋亡研究

用组织培养技术获得黄瓜叶片的愈伤组织,进而培养其悬浮细胞,然后用Na^＋、Ca^2＋、H2O2分别诱导黄瓜叶片悬浮细胞凋亡,并用显微镜观察和琼脂糖凝胶电泳检测其DNA。Na^＋（1．4mol／L）,Ca^2＋（500mmol／L）,H2O2（10％）作用于黄瓜叶片悬浮细胞后,用显微镜观察到凋亡小体;DNA琼脂糖凝胶电泳检测出凋亡时形成的DNA ladder。结果表明：Na^2＋（1．4mol／L）,Ca^2＋（500rmnol／L）,H2O2（10％）都能诱导黄瓜叶片悬浮细胞凋亡。