应用噬菌体检测对虾发光病致病菌哈维氏弧菌的可行性研究

探讨了应用哈维氏弧菌噬菌体检测对虾发光病致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的方法和可行性.实验表明,从对虾育苗场分离的哈维氏弧菌噬菌体对对虾发光病致病菌哈维氏弧菌的噬菌作用具有相当高的特异性,它不能裂解同样来源的溶藻弧菌、副溶血性弧菌、光合细菌,却能特异地裂解本实验所用的不同来源的哈维氏弧菌,噬菌斑出现率可达80%~100%,并且噬菌斑的出现率与虾苗发生发光病的发病程度有一定的相关性,可应用于哈维氏弧菌的检测和对虾发光病致病菌的诊断.     

中国对虾育苗池水中哈维氏弧菌的检测

１９９６年４月～５月,在山东莱州市在大华育苗池,山东即墨市丰城育苗场发病发育池,环境水体及活体饵料中共采集８０份样品,用间接ＥＬＩＳＡ技术对其进行苗期对虾病原菌－哈维氏弧菌的检测,结果表明,发病育苗池中哈维氏弧菌的检出率（５８．３％）明显高于正常育苗池（２０．４％）,证实丰城对虾育苗场暴发的流行病与育苗水体中的哈维氏弧菌有关,大华育苗场育苗水中也检测出哈维氏弧菌,但大华育苗场未发病,说明哈维氏弧菌     

哈维氏弧菌TS-628菌株抗原性研究

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水鱼虾养殖中常见的致病菌,由该菌引发的病害给世界各地的养殖业带来重大经济损失,但对其有效抗原的筛选或相关疫苗的研究报道相当少,对其病害的防治也尚无有效措施.本文以患病青石斑鱼分离到的病原菌哈维氏弧菌TS-628菌株为研究对象,分别提取它的鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)和外膜蛋白(OMP),并采用Western blot技术分析检测这3种成分的抗原性.结果显示,鞭毛蛋白主要的免疫印迹带约有4条,其中43、52 ku为主要免疫反应显色带;OMP主要的免疫印迹带约有5条,其中43 ku为最主要免疫反应显色带, 35、38、47和52 ku也具有较强的免疫显色反应.LPS没有检测到免疫印迹反应.这一研究结果将为灵敏检测哈维氏弧菌以及研制高效疫苗奠定基础.     

2种弧菌鞭毛蛋白的分离纯化与鉴定

尝试分离提取2种弧菌的鞭毛蛋白,采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳对所提蛋白进行分离纯化,Western免疫印迹检测,电镜鉴定。结果显示：实验已经成功分离提纯了哈维氏弧菌的鞭毛蛋白,获得了溶藻弧菌鞭毛蛋白的初提液。提纯的哈维氏弧菌鞭毛蛋白经SDS-PAGE显示3条清晰蛋白带（相对分子量分别为39.7,41.9和42.7KDa）,透射电镜观察表明该蛋白呈经典的丝状,可以认为哈维氏弧菌的鞭毛丝是由相对分子量分别为39.7,41.9和42.7KDa的3种鞭毛蛋白亚基构成。溶藻弧菌鞭毛蛋白的初提液经SDS-PAGE后显示5-9条蛋白带,其中36.8KDa的蛋白带有强的免疫原性。     

哈维氏弧菌黑鲷分离株BK-1培养条件优化研究

从患病黑鲷Sparus macrocephalus 的肾脏分离到一致病菌株BK-1,经鉴定为哈维氏弧菌.对哈维氏弧菌BK-1株的最佳生长条件及培养基优化进行了测定.结果表明:不同的培养条件和培养基成份均会影响其产量.哈维氏弧菌最适宜生长条件为:盐度为2%、pH8、温度为30℃;最佳培养基成份为:蛋白胨0.5%,牛肉膏0.75%,甘油0.05%,CuSO40.15 mg/L,CaCl2 0.01 g/L.     

舟山海域海泥细菌的分离及抗水产病原弧菌的筛选

采集中国东海舟山海域海底不同层次9个海泥样品,通过稀释培养分离纯化得到海洋细菌78株。采用滤纸片琼脂扩散法测定上述分离所得海洋细菌对鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌等5种水产病害常见病原弧菌的抑制作用,获得具有抑弧菌作用的海洋细菌17株,占21.8%。其中6株菌株对费氏弧菌有明显的抑菌作用,占7.7%。7株菌株对哈维氏弧菌的抑菌作用较显著,占9.0%。2株菌株对创伤弧菌有明显的抑菌作用,占2.6%。2株菌株对溶藻弧菌和鳗弧菌显示一定的抑制作用,各占1.3%。研究结果表明:通过稀释培养法能分离到一定数量和种类的海洋细菌;来自海底泥的海洋细菌中存在较多的具有水产病原弧菌拮抗活性的菌株。     

网箱养殖鲈鱼内脏白点病病原的分离与鉴定

2007年5-6月,浙江省象山港海区网箱养殖鲈鱼暴发一种较为严重的传染性疾病.从自然发病和人工感染患病鲈鱼分别分离到LY-1、LY-2菌株.采用常规生理生化指标测定和分子生物学16S rRNA测序分析对病原菌进行分类学鉴定,两者鉴定结果一致并初步确定LY-1、LY-2均为哈维氏弧菌Vibrio harveyi.HSP60序列分析表明,所测病原菌HSP60基因序列与Vibrio harveyi同源性为99%,而与其他弧菌属细菌HSP60基因的同源性均小于91%.综合上述结果,LY-1、LY-2菌株被鉴定为哈维氏弧菌.     

中国对虾血淋巴抗菌活力的测定

采用溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、哈维氏维菌、嗜水气单胞菌对中国对虾血浆样品、血细胞溶解物（ＨＬＳ）样品的抗菌活力进行了测定。表明中国对虾血浆样品对四种细菌均表现出一定的抗菌活力。其中,三种弧菌活细胞数在孵育１ｈ时呈现最低;嗜水气单胞菌活细胞数在孵育４ｈ时最少,在三种弧菌中,血浆样品对哈维氏弧菌表现出的抗菌活力最强,而对副溶血弧菌表现出的抗菌活力最弱。血细胞溶解物样品对三种弧菌几乎没有表现出抗菌活力;嗜     

四种发光细菌的生物发光的微分光谱

以明亮发光杆菌,福鱼发光杆菌,哈维氏弧菌和青海弧菌,四种发光菌,每种选取二个菌株检测其生物发光的一阶和二阶微分光谱。结果表明不同种的发光细菌的微分谱有显著差异,同一种菌的不同菌株则无显著差异,提示生物发光光谱,微分光谱可作为发光细菌菌种分类的特征。     

南美白对虾虾苗淡化期间发光病病原研究

2002年,浙江某南美白对虾(Penaeusvannamei)苗种场在虾苗淡化过程中发生了发光病.通过对典型发光病虾的镜检、细菌分离,结果从濒死病虾体内分离到4株细菌,其中菌株Pv-1在TCBS和TSA培养基上均能发光,用此菌株浸泡感染健康南美白对虾,可复制出发光病虾,且有较高的死亡率。对Pv-1进行了培养特性和生化特性鉴定,确定Pv-1为革兰氏阴性菌,菌体呈直杆状,大小为1.5μm×0.8μm,极生单鞭毛运动,氧化酶阳性,发酵葡萄糖,对弧菌抑制剂0 129(150μg)敏感,经鉴定为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi).由此表明哈维氏弧菌为此次南美白对虾虾苗淡化期间发光病的病原.     

基于核酸适配体吸附检测技术的卵形鲳鲹源溶藻弧菌的快速检测

溶藻弧菌是引起广西等华南沿海地区海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一,其引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点,严重威胁着华南地区水产养殖业的健康可持续发展。着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的水产致病菌快速检测技术,对于及早发现、确定病原,进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失意义重大。在先前研究中,我们基于指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology,SELEX)筛选获得特异性识别卵形鲳鲹源溶藻弧菌的核酸适配体,本研究中我们基于核酸适配体VA8开展溶藻弧菌的快速检测诊断技术的研究,开发出一种新型的能够快速检测溶藻弧菌的核酸适配体吸附检测技术(Aptamer VA8-based enzyme-linked aptasorbent assay,VA8-ELASA),并对VA8-ELASA技术检测溶藻弧菌的特异性和灵敏性进行分析研究。VA8-ELASA技术可以用于溶藻弧菌的快速检测,具有特异性强、灵敏度高的特点。本研究基于核酸适配体VA8建立的新型核酸适配体吸附技术(VA8-ELASA),有望实现对广西卵形鲳鲹养殖中溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

水生生物病原核酸适配体研究进展

核酸适配体(Aptamer)是指利用指数富集配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到的能特异性识别和结合靶标的ssDNA或RNA分子,具有高亲和力和高特异性的特点,在快速检测和靶向治疗方面应用广阔。近年来,水生生物细菌和病毒性病原疾病的频繁暴发,严重制约了水生态的健康以及水产养殖业的迅速发展。核酸适配体作为一种新型的识别分子,在水生生物病原的应用上也已取得了一些进展。本文对水生生物细菌和病毒性病原核酸适配体的筛选,及其在检测和治疗领域的研究现状进行综述,并对该领域核酸适配体技术的应用方向进行展望。     

运用SELEX技术筛选嗜水气单胞菌适配子

以嗜水气单胞菌为研究对象,采用适体筛选技术(SELEX,system evolution of ligands by expo-nential enrichment),利用体外合成的长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,以嗜水气单胞菌为靶目标进行12轮的筛选,利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力.研究结果表明:随着筛选轮数的增加,DNA适配子与嗜水气单胞菌结合后显色,A(absorbance)值逐渐增加,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72.研究已初步筛选到与嗜水气单胞菌具有高亲和力的DNA适配子,为嗜水气单胞菌的二级结构研究及其检测试剂盒的研发提供了基础.     

基于适配体的胶体金色谱层析试纸条快速检测肌酸激酶同工酶

研究基于适配体的胶体金色谱层析试纸条快速检测肌酸激酶同工酶,用于揭示长期飞行下航天员潜在的心肌和肌肉损伤.利用SELEX方法筛选得到的肌酸激酶同工酶适配体,并优选出与肌酸激酶同工酶有较强亲和能力的核酸适配体应用于胶体金免疫层析试纸条,通过优化胶体金颗粒大小、缓冲液浓度等条件,成功建立了一种基于适配体的胶体金试纸法用于CK-MB的快速检测.实验结果表明,通过基于磁珠的核酸适配体筛选方法筛选出的与肌酸激酶同工酶有亲和力的核酸适配体,能够用于构建适配体-适配体夹心胶体金免疫层析试纸条并成功应用于82 nM以上的肌酸激酶同工酶的快速、可视化检测,同时,该免疫层析试纸条具有良好的特异性和稳定性,可用于未来空间医学即时检测.     

一种水产弧菌快速药敏检测方法的建立

【目的】实现弧菌药物敏感性的现场快速检测。【方法】以副溶血性弧菌、溶藻弧菌及灿烂弧菌3种弧菌为试验菌株,在Mueller-Hinton(MH)培养基基础上通过添加鱼肉蛋白胨及调节无机盐离子浓度,优选弧菌的增菌液。同时利用阿尔玛蓝作为颜色指示剂,选择11种水产常见药物并设置8个倍比稀释的浓度梯度,结合运用海藻糖作为包被保护剂,制备弧菌快速药敏检测微孔板,板内设有药敏检测区、生长对照区及质控区。【结果】利用药敏微孔板法及传统的试管稀释法分别对副溶血性弧菌、溶藻弧菌及灿烂弧菌进行药敏检测,结果显示微孔板法测定的所有药物对3种弧菌的MIC值与试管稀释法完全吻合。【结论】本研究建立的药敏微孔板法能够实现对3种弧菌药敏特性的快速、简便、准确检测,研究结果将为水产病原微生物的现场快速选药技术提供重要参考。     

威灵仙水提物对卵形鲳鲹源溶藻弧菌的抑制作用

近年来水产养殖行业不断扩大,但随之而来的鱼病对养殖行业造成了巨大损失.本研究以卵形鲳鲹(前期发病)上分离出的溶藻弧菌为实验对象,批量筛选多种中草药,选择抑菌效果最好的一种或几种中草药,并探究不同浓度中草药水提物的抑菌效果,确定其杀菌浓度(MBC)及最小抑菌浓度(MIC),再通过生化指标胞内乳酸脱氢酶(Lactate d...     

P-糖蛋白的核酸适配体筛选及应用研究

基于SELEX技术筛选P-糖蛋白（permeability glycoprotein,P-gp）的特异性核酸适配体（aptamer,Apt）,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）法、表面等离子体共振（SPR）法表征了Apt与P-gp的结合能力,采用与P-gp结合能力最强的Apt5在人结直肠腺癌细胞（Caco-2）、人脑微管内皮细胞（hCMEC/D3）两种细胞系上考察了对P-gp外排功能的抑制效果.筛选得到10条长度为81 bp的P-gp核酸适配体,结合能力大小顺序为:Apt5>Apt8>Apt1>Apt4>Apt6>Apt10>Apt7>Apt2>Apt9>Apt3.Apt5使hCMEC/D3及Caco-2细胞内罗丹明123的蓄积量分别增加了40.77%（P<0.01）,32.39%（P<0.05）,能潜在抑制P-gp的外排功能.本研究首次报道了P-gp的多条核酸适配体,与P-gp有较强的结合能力,并能抑制P-gp的外排功能,有望成为P-gp的潜在新型抑制剂.      

利用SELEX技术筛选小檗碱核酸适配体及其亲和力表征

小檗碱是一种价格低廉且生物安全性良好的小分子化合物,筛选能与小檗碱互相作用的核酸片段,旨在开发新型遗传元件并拓展其在生物技术领域的应用。利用指数富集的配基系统进化技术（SELEX）,经8轮实验从随机单链DNA文库中筛选出4条能与小檗碱高度特异性结合的核酸适配体。对其中两条重现性较好的适配体进行结构模拟分析表明,适配体序列富含鸟嘌呤和胞嘧啶且多形成茎环及G-四链体结构。亲和力测定结果显示,其中的2条核酸适配体与小檗碱作用的解离常数K_d都处于nmol级,表现出较高的亲和力,适配体S1的K_d值最小,仅为523 nmol/L,与小檗碱亲和力最大。     

卵形鲳鲹源创伤弧菌导致宿主细胞凋亡的作用机制

弧菌是自然界菌群中的一部分,作为一种有害菌不仅可以感染常见的水产品,有些弧菌更是对人体有一定的致病性。随着近些年水产养殖的不断扩大,由创伤弧菌(Vibrio vulnificus)引起的鱼病不胜枚举,不仅给养殖行业造成巨大的损失,同时对人类生命安全也存在着巨大威胁。本文对卵形鲳鲹源创伤弧菌感染宿主细胞的机制进行研究,目的是阐明创伤弧菌对宿主细胞的致死机理,为未来研发抗病菌功能产品提供理论依据。本文通过确定创伤弧菌胞外产物(Extracellular products,ECPs)的蛋白浓度,以不同的蛋白浓度为基准,利用光镜观察和细胞活力CCK检测技术测定创伤弧菌ECPs对细胞的毒性。然后使用Hoechst 33342染核观察及DNA ladder来进一步确定其致死机制。根据细胞毒性结果,卵形鲳鲹源创伤弧菌ECPs对宿主细胞有很强的细胞毒性。Hoechst 33342染核结果发现实验组出现了凋亡小体,这与STS处理的阳性对照组中细胞变化相一致。但是ECPs处理后的宿主细胞未出现明显的DNA ladder。卵形鲳鲹源创伤弧菌对宿主细胞具有明显的毒性,再通过理化性质的检测,可以初步确定创伤弧菌导致卵形鲳鲹细胞死亡是通过凋亡途径发生的。未来将针对凋亡途径的具体通路进行深入研究,为控制病菌的感染提供理论依据。     

基于核酸适配体Q5的石斑鱼虹彩病毒快速检测技术

石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus,SGIV)在不同鱼群之间迅速传播,其致死率极高,严重制约了我国海水石斑鱼(Epinephelus tauvina)养殖业健康可持续发展。为了及早发现和鉴定出病原,降低经济损失,促进渔业发展,开发方便快捷的石斑鱼虹彩病毒检测技术已迫在眉睫。本研究基于核酸适配体Q5,研发出一种核酸适配体Q5-荧光分子探针(Aptamer Q5-based fluorescent molecular probe,Q5-AFMP),并且对Q5-AFMP检测感染石斑鱼虹彩病毒的特异性,以及Q5-AFMP在细胞水平和组织水平检测石斑鱼虹彩病毒感染的灵敏度进行分析。研究结果表明:Q5-AFMP能够在细胞水平和组织水平高特异性检测出石斑鱼虹彩病毒的感染,而且具有较高的灵敏度。因此Q5-AFMP能够用于石斑鱼虹彩病毒的快速检测和诊断。