寡聚核糖核苷酸降解酶影响铜绿假单胞菌的能量代谢

铜绿假单胞菌是一种自然界中广泛存在的革兰氏阴性条件致病菌.在该菌的RNA代谢过程中,存在一种以NanoRNA(2-5nt的寡聚核糖核苷酸)为底物的寡聚核糖核苷酸降解酶(Oligoribonuclease, Orn).在本研究中,发现铜绿假单胞菌orn突变菌株的生长速度变慢,因此使用ATP,NADH检测试剂盒,利用酶标检测法和流式细胞分析研究Orn对细菌生理状态的影响.研究结果表明,铜绿假单胞菌orn基因的缺陷可以导致细菌胞内NADH和细菌细胞膜电位差的降低.这进一步导致细菌胞内ATP合成的降低,从而影响细菌的能量代谢.     

铜绿假单胞菌外膜亚蛋白质组图谱的建立

铜绿假单胞菌是人类重要的病原菌,容易造成免疫缺陷患者如烧伤、艾滋病、癌症或囊性纤维化感染,对该菌外膜蛋白的研究有助于了解该菌的致病机制,为进一步疫苗研制奠定基础.采用月桂酰基氨酸钠的方法提取了铜绿假单胞菌的外膜蛋白,首次建立了外膜亚蛋白质组学表达图谱,鉴定了23个外膜蛋白,占所鉴定蛋白的82.1%.然后对其中的一个外膜蛋白基因PA3988进行了克隆及原核表达与纯化,经免疫小鼠获得抗血清后对外膜蛋白进行双向Western blotting分析,验证了质谱的结果.这些研究结果对铜绿假单胞菌外膜蛋白的深入研究具有积极作用.     

铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶的酶学特性及菌株检测

铜绿假单胞菌为条件致病菌,是目前各种医院内感染最广泛、最严重的致病菌之一.以分离自公共场所洗手液的菌株6-3为研究对象,其16S rRNA基因与Pseudomonas aeruginosa DSM 50071的16S rRNA基因的一致性为99.8%,初步确定其为铜绿假单胞菌;根据同源蛋白的核苷酸序列设计菌株6-3中丙氨酸消旋酶的扩增引物,通过PCR从6-3菌株中克隆获得了丙氨酸消旋酶基因(alrPa),基因序列与P. aeruginosa PAO1中丙氨酸消旋酶Alr_(PAO1)的氨基酸同源率为98.9%,存在4个不一致的氨基酸位点;经原核表达、Ni-NTA亲和层析法纯化获得了蛋白PaAlr,酶学特性分析表明,重组蛋白PaAlr的最适反应温度为40℃,最适反应pH=10.0;最适底物是L-Ala,具有严格的底物特异性,K_(m,L-Ala)=10.96mmol/L,V_(max,L-Ala)=1 562μmol/(L·min),K_(m,D-Ala)=8.45mmol/L,V_(max,D-Ala)=881.9μmol/(L·min),其最大反应速率约为Alr_(PAO1)的7倍;以铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶为检测对象,以PCR和Western-blotting 2种方法对铜绿假单胞菌进行检测,实验发现,在目的基因序列已知的前提下,采用PCR法具有较好的检测灵敏性和专一性.     

中草药对铜绿假单胞菌及其群体感应抑制作用

为了筛选对多重耐药铜绿假单胞菌具有抑菌作用的中草药,并筛选铜绿假单胞菌的群体感应蛋白LasR的抑制剂,本实验利用纸片扩散法对59株临床分离的铜绿假单胞菌和1株PAO1进行抗生素药敏试验,并对其中3株菌进行中草药提取物体外抑菌试验,通过检测报告质粒中β-半乳糖苷酶的活性来筛选LasR蛋白抑制剂。实验发现,丁香、赤芍等中药粗提物具有良好的抑菌效果,部分中草药可通过影响LasR蛋白的水溶性或信号分子与受体蛋白的结合来实现对细菌群体感应的调控。     

应用正交实验研究铜绿假单胞菌原生质体制备与再生

通过对铜绿假单胞菌原生质体制备与再生进行正交实验,探讨各因子对铜绿假单胞菌原生质体制备与再生影响水平,得到铜绿假单胞菌原生质体制备与再生的最优条件:酶解时间 0. 5h,酶浓度 2mg/L,菌龄为 15h 此时原生质体形成率为 80. 5%,再生率为 20. 6%     

一株新铜绿假单胞菌噬菌体SRT6的分离以及全基因组序列分析

分离一株新铜绿假单胞菌噬菌体,进行生物学特征分析,全基因组测序和比较基因组学分析.了解该噬菌体与其他假单胞菌噬菌体之间的亲缘关系以及它的潜在应用价值.利用双层平板法分离纯化噬菌体,利用酚氯仿抽提基因组,利用Illumina Hiseq测序平台对基因组测序,利用生物信息学进行基因组和比较基因组学分析.分离到一株新的烈性铜绿假单胞菌噬菌体SRT6,其基因组全长91 364bp,G+C含量49.3%,存在182个蛋白质编码基因,其中的96个与已知功能的蛋白质具有相似性,无tRNA和tmRNA.比较基因组分析发现,噬菌体SRT6属于一个新物种.分离鉴定出一株烈性铜绿假单胞菌噬菌体SRT6,并发现它属于一个新种噬菌体,为未来利用噬菌体治疗耐药铜绿假单胞菌感染打下坚实的基础.     

抑制铜绿假单胞菌生长的噬菌体K4基因的筛选

噬菌体基因组携带多种影响宿主菌生长的基因,是筛选新型抗菌素的可能靶位.本研究分别克隆铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体K4携带的全部75个基因,在阿拉伯糖启动子控制下进行表达.实验结果表明,6个噬菌体基因的表达产物能够显著抑制宿主菌的生长.生物信息学分析显示,基因gp72编码的末端酶大亚基与噬菌体基因组包装过程相关,基因gp49编码假定的5′-3′核酸外切酶,其余4个基因编码产物未发现特定的蛋白结构域.利用脉冲场凝胶电泳分析宿主菌染色体DNA的完整性,在阿拉伯糖诱导5,h时,蛋白Gp17、Gp41、Gp72、Gp29和Gp49能够导致宿主菌染色体DNA的显著降解,这是抑制宿主菌生长的可能原因.蛋白Gp67对宿主菌染色体DNA没有影响,其抑制细胞生长的机制不同于其他蛋白.实验还发现,筛选基因的产物还能影响噬菌体的感染效率.本研究发现的抑制细菌生长的基因,能够为筛选新型抗菌素提供新的靶位.     

福建、陕西两地荧光假单胞菌NRPS基因的多态性

在环脂肽NRPS基因C1、Te保守区各设计一对引物,利用PCR技术,从福建和陕西两地的土样中筛选携带环脂肽NRPS基因的荧光假单胞菌,运用SSCP、酶切分型的方法分析NRPS基因的多态性。结果显示,福建、陕西两地菌株的C1和Te保守区经SSCP电泳后所得的条带数均有3、5、7带型,且条带位置有差异。据统计,两地C1区均有10个分型,Te区总计10个分型。其中福建菌株Te区有9个分型,无SSCP-10型;陕西菌株Te区有8个分型,无SSCP-2、SSCP-4型。用限制性内切酶HinfⅠ和SphⅠ对NRPS基因Te区进行酶切,福建菌种Te区扩增产物的酶切产物分为15种,陕西菌种Te区的酶切产物分为11种。表明荧光假单胞菌NRPS基因具有多种形态,且不同地区的类型分布有所差异。相较之下,福建菌株的NRPS基因多样性更好,更有可能获得活性较强或产新型环脂肽的菌株。     

应用RAPD技术研究金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌DNA的多态性

本试验利用RAPD技术对临床上重要的致病菌金黄色葡萄球菌28株和铜绿假单胞菌2l株，用10bp引物进行扩增，结果铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的DNA带谱均出现了多态性；根据带谱的不同可将铜绿假单胞菌分成8个型，金葡菌分成3个型；根据铜绿假单胞菌的带型计算各菌间的相似系数，依此系数绘制了系统树，从系统树中清晰可见各菌间的亲缘关系。     

烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌的分离及耐药性分析

目的 了解烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌耐药谱的变化,为防治烧伤病区患者感染铜绿假单胞菌提供合理用药依据.方法 常规方法收集同一时间烧伤病房9名感染患者的患部浓汁和血液标本,分离鉴定出9株铜绿假单胞菌,K-B法进行药敏试验及统计学分析.结果 9株铜绿假单胞菌对氨苄西林、哌拉西林、亚胺培南/西司他丁、头孢他啶、氨曲南、阿米卡星、复方磺胺等11种抗菌药物耐药率均为100%.结论 烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌耐药现象严重,应注意铜绿假单胞菌耐药性的监测.     

成都地区60株铜绿假单胞菌中第I类整合子的鉴定及特性分析

采用两种PCR法(整合酶PCR法和长片段整合子PCR法)检测60株成都地区4家医院分离的铜绿假单胞菌的第Ⅰ类整合子,并对扩增产物进行序列分析.对60株铜绿假单胞菌第Ⅰ类整合酶基因的检测,发现有28株扩增结果为阳性(46.7%),所扩增片段的大小为110 bp.测序结果与GenBank中已报道的ⅠntI1基因核酸序列同源性为100%.长片段PCR法扩增Ⅰ类整合子的可变区,60株铜绿假单胞菌中有18株检测到不同大小的Ⅰ类整合子基因盒,占标本总数的30.0%.插入的基因盒大小从300 bp到超过2000 bp不等,18株整合子阳性菌中,有两株菌同时含有2种大小不同的整合子.序列分析结果表明,菌株R03的1900 bp 整合子携带aacA4基因盒,菌株W13的1900 bp整合子中含dfr17和aadA5基因盒.     

苦参与环丙沙星合用对铜绿假单胞菌生物膜的影响

采用体外复制铜绿假单胞菌生物膜模型,研究了苦参水煎液与环丙沙星联合应用对铜绿假单胞菌生物膜的影响及协同杀菌效果,结果显示,1/16、1/4最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration MIC)的苦参水煎液可显著增加1/41、/2 MIC的环丙沙星对铜绿假单胞菌生物膜的抑菌活性,两药合用具有明显的协同作用.     

临床分离铜绿假单胞菌病区分布及耐药性分析

目的:了解铜绿假单胞菌各病区分布情况及耐药性变迁,预防和控制院内感染的发生,减缓耐药菌株的出现,延长现有抗生素的使用期限。结果:临床分离铜绿假单胞菌103株,38株来自呼吸科,81株来自痰标本,产金属酶的有7株,占分离菌株的6.8%,其中4株分离自神经外科昏迷伴器官切开的患者痰液中,3株分离自ICU病房。结论:分离的铜绿假单胞菌科室以呼吸科居多,标本类型以痰居多;耐亚胺培南的铜绿假单胞菌对许多抗生素的耐药率均高于敏感株。     

铜绿假单胞菌的耐药现状及外膜孔蛋白分析

目的:总结分析我院2007年-2009年铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药状况,以指导临床合理选用抗生素,同时探讨外膜孔蛋白缺失介导的铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制.方法:采用PCR方法检测外膜孔蛋白OprD的编码基因,利用Whonet 5.4 软件对药敏资料进行统计分析.结果:3年中铜绿假单胞菌每年的分离数量分别为13...     

茶多酚对假单胞菌抑菌机理研究

以铜绿假单胞菌为研究对象,研究了茶多酚的抑菌作用和抑菌机理。首先通过抑菌实验确定了茶多酚对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为0.075%。研究了茶多酚对铜绿假单胞菌生长曲线的影响。通过茶多酚对碱性磷酸酶和三磷酸腺苷酶,以及细菌总蛋白和膜蛋白影响的研究,结果表明：茶多酚可以降低细菌体内的碱性磷酸酶和三磷酸腺苷酶的活性,对细菌总...     

褐球固氮菌和荧光假单胞菌原生质体制备条件的研究

为了利用原生质体融合技术获得同时具备固氮、解磷、抑病等活性的多功能菌株,本文对褐球固氮菌A41和荧光假单胞菌P32原生质体的制备条件进行了研究。通过对菌龄、酶解温度、酶浓度、酶解时间等影响因素的正交实验确定了褐球固氮菌A41和假单胞菌P32原生质体制备的最佳条件。实验结果表明,固氮菌A41最佳制备条件为菌龄20h、酶解温度37℃、酶浓度3mg/mL、酶解时间45min;假单胞菌P32最佳制备条件为菌龄20h、酶解温度37℃、酶浓度2mg/mL、酶解时间30min。     

铜绿假单胞菌PA0057基因的克隆、表达及其重组蛋白活性的初步研究

铜绿假单胞菌PA0057基因为Ⅳ类未知基因,通过NCBI比对,发现PA0057基因编码的蛋白与金属β-内酰胺酶同源性为96%,因此推测PA0057蛋白可能具有金属β内酰胺酶活性.提取铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA,利用设计的引物通过PCR方法扩增得到PA0057基因,将其克隆至克隆载体pGEM-T,并转化人大肠杆菌DH5α;而后将其克隆至表达载体pET28a中,转化人大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,并通过Ni-NTA亲和柱进行纯化,纯化后蛋白超滤浓缩得高浓度蛋白;通过药敏纸片检测PA0057蛋白活性.     

铜绿假单胞菌PA0057基因的克隆、表达及其重组蛋白活性的初步研究

铜绿假单胞菌PA0057基因为Ⅳ类未知基因,通过NCBI比对,发现PA0057基因编码的蛋白与金属β-内酰胺酶同源性为96%,因此推测PA0057蛋白可能具有金属β内酰胺酶活性.提取铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA,利用设计的引物通过PCR方法扩增得到PA0057基因,将其克隆至克隆载体pGEM-T,并转化人大肠杆菌DH5α;而后将其克隆至表达载体pET28a中,转化人大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,并通过Ni-NTA亲和柱进行纯化,纯化后蛋白超滤浓缩得高浓度蛋白;通过药敏纸片检测PA0057蛋白活性.     

铜绿假单胞菌mexS基因对其运动能力的影响

使用同源重组方法构建mex S基因突变菌株PAO1mex S::Ω,检测其与铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1泳动,蹭行运动及蜂群运动能力.结果表明:与野生型菌株相比,PAO1mex S::Ω这3种运动能力均显著增加;构建mex S互补菌株PAO1mex S::ΩC,通过检测互补株的泳动、蹭行运动及蜂群运动能力,发现mex S基因回复了突变株这3种运动能力.为了探索mex S基因调控这3种运动能力的分子机制,进一步提取了PAO1与PAO1mex S::Ω菌株RNA,使用RNA测序技术比较两者全基因组转录水平,结果发现与野生型菌株相比,PAO1mex S::Ω中部分运动能力相关基因的表达水平发生了明显地变化.本文首次报道mex S基因影响铜绿假单胞菌的运动能力.     

丁硫克百威降解菌的筛选、鉴定及其降解产物初步分析

为了分离筛选丁硫克百威农药的高效降解菌并对其降解产物进行分析,本研究从石河子大学农学院试验站采集土样15份,采用富集培养的方法筛选丁硫克百威降解菌,通过生理生化和分子生物学试验鉴定降解菌,应用高效液相色谱和质谱法检测分析其降解产物。结果表明:筛选得到1株丁硫克百威降解菌ZJ-11,将该菌株鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。此菌株可以在5 d内将浓度为500 mg/L的丁硫克百威降解53.72%。通过质谱分析确定其降解产物主要为克百威。