五指山小型猪PMSA6基因cDNA克隆及生物信息学分析

为了对海南五指山小型猪蛋白酶体亚基α型6（proteasome subunit alpha type 6,PMSA6）cDNA基因进行克隆和生物信息学分析,笔者以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到PMSA6全长cDNA,并向GenBank递交了该序列（登录号：FJ358606）．同时运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行了分析,并预测了其编码蛋白的理化性质及二级结构等．生物信息学分析表明：该cDNA全长1029bp,5’非翻译区长96bp,3’非翻译区长192bp,含有一个741bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸．该蛋白的分子量为37．680kD,等电点为8．76．进一步比对分析发现,五指山小型猪PMSA6基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、牛等哺乳动物具有很高的相似性．本研究成功克隆了海南五指山小型猪P肛SA6基因cDNA,并进行了相关生物信息学分析,为进一步研究PMSA6在动物体内的作用机理奠定了基础．     

簇毛麦(Haynaldia villosa)gibberellin 3β-hydroxylase基因的克隆和序列分析

以簇毛麦(Haynaldia villosa,2n=14,VV)为材料,提取总RNA,以大麦,小麦GA3ox序列设计同源引物,通过RT PCR方法,获得了簇毛麦GA3β-羟化酶(gibberellin 3β-hydroxylase,GA3ox)多基因家族中一个cDNA克隆,暂命名为HvGA3ox.该cDNA全长1206bp,含完整编码区1104 bp,推测该序列编码蛋白含368个氨基酸残基,分子量为40.063 KD,等电点为6.27.预测的氨基酸序列含有双加氧酶的活性结构,在酶活性中心2个Fe离子结合的氨基酸残基非常保守.该序列与小麦、大麦和水稻的GA3氧化酶基因一致性分别为98%、96%、86%.为以后进一步分析HvGA3ox的结构及其与功能关系,〖JP2〗还以簇毛麦总基因组为模板,扩增得到一个1582 bp的克隆,该序列与cDNA序列在外显子部分一致,在478~715 bp和879~1019 bp处分别含238 bp和140 bp的内含子.该基因的克隆为进一步研究该基因的功能和结构奠定了基础.     

羊草LVAP1基因的克隆及生物信息学分析

克隆羊草VHA-c基因并预测其编码蛋白质结构和功能.由羊草总RNA经RACE克隆获得VHA-c基因cDNA,采用生物信息学方法预测蛋白结构和功能.获得羊草VHA-c基因cDNA,命名为LVAP1基因(GenBank登录号为GQ397276),LVAP1基因开放阅读框为498 bp,编码165个氨基酸,有4个α-螺旋跨膜结构域,在第4个结构域上含有一个高度保守的G lu142残基,推测它是质子的结合位点.进化树分析显示,羊草LVAP1蛋白与小麦、碱蓬和冰叶日中花等植物的VHA-c蛋白具有高度的同源性,推测LVAP1亚基与其他VHA-c亚基执行相似的功能.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

人Oligophrenin 1样(OPHN1L)基因的克隆

将人Oligophrenin 1(OPHN1)基因编码区2406 bp与EST数据库进行同源性分析,得到一个363 bp的EST AA035622与OPHN1基因编码区一致性为62%,该EST与一个cDNA序列AB014521完全匹配.在ABO14521中设计引物与cDNA文库载体臂上引物行巢式PCR扩增并进行5′RACE,在胎盘cDNA文库中获得cDNA序列606bp,与AB014521拼接成一个6906 bp的cDNA序列,其中包含一个2442 bp的开放阅读框,编码813个氨基酸.该cDNA序列的GenBank登录号为AF141884,并经GDB命名委员会命名为OPHN1L基因.OPHN1L基因3′端与大规模测序的BAC克隆AC005348及AC004782完全匹配,从而将该基因定位于5q21.2～q21.3,并由此获得它的部分基因组结构.     

黑线仓鼠AVP基因部分序列的系统进化及结构分析

根据GenBank中黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）同源物种的AVPcDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术得到了黑线仓鼠精氨酸加压素（AVP）基因部分cDNA序列,包括外显子2的全部序列和外显子1、3的部分序列,共433bp,并注册到GenBank（登录号：JN227681）。该段序列共编码143个氨基酸,二级结构预测显示片段中含较多的a螺旋。该序列与其他物种相应区域的比较结果表明其同源性为84％～92％,氨基酸序列同源性为82％-93％。系统进化分析结果与物种亲缘关系的远近一致,该序列的克隆为研究AVP的表达调控机制奠定了基础,将有助于AVP的作用机制的研究及功能分析,同时该cDNA序列可作为物种亲缘关系或遗传距离研究的理想标记。     

水稻几丁质酶基因(Oschi)cDNA的克隆及序列分析

 以成功克隆大蕉几丁质酶基因（MpChi-1）时设计的一对引物,采用RT-PCR技术从广亲和水稻品种（Oryza．satival L．Cpslo17）中扩增到一水稻几丁质酶的全长cDNA,长1 115 bp,命名为Oschi;此序列已在GenBank中注册,登录号为EU045451;将Oschi基因核苷酸测序结果在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索;并将Oschi的cDNA序列及氨基酸序列与大蕉及其它单子叶植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树;结果显示此基因具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构;与大蕉核苷酸序列相比同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,与预测登记的最相近的水稻［Oryza sativa(japonica cultivar-group)］核苷酸序列相比同源性为98%, 氨基酸序列同源性为98%;广亲和水稻Oschi基因与大蕉MpChi-1基因的序列及蛋白结构有较高的一致性。     

马铃薯‘转心乌’F3′5′H的cDNA克隆、原核表达和生物信息学分析

花色苷合成途径中,类黄酮-3'5'-羟基化酶是合成-3'5'-羟基花色素苷的关键酶。从‘转心乌’块茎嫩芽提取总RNA,通过RT-PCR克隆到F3'5'H的cDNA序列(GenBank登录号为HQ860267),SDS-PAGE获得表达蛋白的分子量约为55 k Da。该基因全长1 518 bp,编码区长1 485 bp,共编码494个氨基酸。     

小黑麦NAC转录因子基因TwNAC01克隆及生物信息学分析

NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)是在调控植物发育、衰老、生物与非生物逆境以及激素反应等方面具有重要作用的一类转录因子。为探索六倍体小黑麦耐干旱机制,本研究以六倍体小黑麦为材料,利用快速扩增cDNA末端(RACE)与反转录·聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆到1条NAC转录因子cDNA全长,分析了其生物信息学特点,同时利用实时定量PCR技术分析其在干旱胁迫下的组织部位表达特点。结果表明,所克隆小黑麦基因ORF全长1 059 bp,编码352个氨基酸。该基因预测蛋白中具有NAM亚家族保守的氨基酸序列,且其预测蛋白氨基酸序列与山羊草中的NAC转录因子氨基酸序列同源性高达90%以上。该基因预测蛋白属亲水性蛋白,无跨膜结构域与信号肽区域,二级结构包含45个α-螺旋,57个β-折叠和250个无规则卷曲。预测蛋白定位于细胞核内。在干旱胁迫下,该基因在开花后22 d的小黑麦幼粒和根部的表达量明显高于茎和叶,且表达量显著受干旱胁迫诱导。可见所克隆的基因为小黑麦NAC转录因子,将其命名为TwNAC01(GenBank登录号为MG736919),其在小黑麦抗旱应激反应中具有重要作用。小黑麦NAC转录因子基因TwNAC01的克隆对于揭示小黑麦的抗旱性机制以及小黑麦抗旱基因工程育种具有重要意义。     

枸杞抗坏血酸氧化酶基因的克隆与表达分析

以枸杞为材料,利用同源克隆技术,克隆了枸杞抗坏血酸氧化酶(AO)的全长cDNA序列,命名为LcAO基因(GenBank:KP712033),该基因开放阅读框(ORF)大小为1737bp,编码578个氨基酸,与西红柿AO蛋白的同源性达到90%.LcAO编码的氨基酸序列包含3个多铜氧化酶结构域和跨膜信号序列.采用实时荧光定量PCR分析显示,LcAO基因在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少.     

Molecular cloning of a full-length cDNA for ECBP21 from Angelica dahurica

ECBP21 is an extracellular calmodulin-binding protein which was first detected and purified from extracellular extracts of suspension-cultured cells of Angelica dahurica. The purified protein was electroblotted onto PVDF membrane and the amino acid sequences from 1 to 20 were determined. Using degenerate oligonucleotides of the sequence, a full-length cDNA coding for ECBP21 was isolated by a combination of RT-PCR and 5′-RACE cloning. The cDNA contains 947 nucleotides and codes for a precursor protein of 216 amino acids. The N-terminal 1-25 amino acid sequence is a predicted signal peptide and the other 26-216 amino acid sequence is a mature peptide. The 26-45 amino acid sequence shows identity with the N-terminal amino acid sequence of purified ECBP21 from Angelica dahurica. The fragment of encoding the mature protein was cloned into pET-28b(+) and transformed into E. coli BL21(DE3). A protein with relative molecular mass 21 ku was expressed in E. coli. Using a biotinylated-CaM gel overlay technique, the expression protein was tested for its ability to bind CaM. The results indicated that the expression protein is a Ca2+- dependent CaM-binding protein. Thus, these results further defined the cDNA clone for ECBP21. This work laid a foundation for elucidating biological functions of ECBP21 by using molecular biological means.     

Molecular cloning of a fulllength cDNA for ECBP21 from Angelica dahurica

ECBP21 is an extracellular calmodulin-binding protein which was first detected and purified from extracellular extracts of suspension-cultured cells of Angelica dahurica. The purified protein was electroblotted onto PVDF membrane and the amino acid sequences from 1 to 20 were determined. Using degenerate oligonucleotides of the sequence, a full-length cDNA coding for ECBP21 was isolated by a combination of RT-PCR and 5′-RACE cloning. The cDNA contains 947 nucleotides and codes for a precursor protein of 216 amino acids. The N-terminal 1–25 amino acid sequence is a predicted signal peptide and the other 26–216 amino acid sequence is a mature peptide. The 26–45 amino acid sequence shows identity with the N-terminal amino acid sequence of purified ECBP21 from Angelica dahurica. The fragment of encoding the mature protein was cloned into pET-28b(+) and transformed into E. coli BL21(DE3). A protein with relative molecular mass 21 ku was expressed in E. coli. Using a biotinylated-CaM gel overlay technique, the expression protein was tested for its ability to bind CaM. The results indicated that the expression protein is a Ca²⁺-dependent CaM-binding protein. Thus, these results further defined the cDNA clone for ECBP21. This work laid a foundation for elucidating biological functions of ECBP21 by using molecular biological means.     

西瓜八氢番茄红素合成酶基因全长的克隆与表达分析

通过RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中克隆八氢番茄红素合成酶（PSY）基因的cDNA全长,用生物信息学方法对其cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,并用实时荧光定量PCR技术研究PSY在不同瓤色西瓜果实发育过程中的表达情况.结果表明,PSY基因cDNA全长1 561 bp（GenBank登录号为KC166870）,其开放阅读框为1 266 bp,编码421个氨基酸.该基因及其推导的氨基酸序列与同为葫芦科的其他植物的PSY及氨基酸序列的同源性分别为87％和91％以上;序列分析显示,PSY氨基酸序列N末端存在转运肽信号序列.不同瓤色西瓜果实发育过程中PSY的表达存在明显差异,红瓤果实中的表达量最高,这表明PSY可能与红瓤果实中积累较多的类胡萝卜素有关;PSY的表达量均高于PSY-A,推测PSY基因主要负责果实中类胡萝卜素的合成.     

扩展莫尼茨绦虫反应元件结合蛋白基因的克隆和cDNA序列分析

克隆扩展莫尼茨绦虫（Moniezia expansa）新基因,通过生物信息学方法分析该基因的生物学信息,初步预测该基因的功能,为进一步研究扩展莫尼茨绦虫并以其作为模式生物,为人类的某些基因未知功能的研究提供基础。构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克降进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;在NCBI上对该cDNA序列进行开放阅读框（ORF）的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质二级结构的初步预测。结果：获得了1个扩展莫尼茨绦虫基因－应结合蛋白,全长1861bp,编码592个氨基酸,属于DUF906家族,与曼氏血吸虫反应结合蛋白基因具有72．1％的同源性。编码蛋白的理论分子量为69．7653kDa,等电点为9．83.结论：获得了扩展莫尼茨绦虫反应结合蛋白的全长cDNA序列,对该基因功能的初步预测,它是一种基因转录因子,在扩展莫尼茨绦虫虫体中的具体作用机制目前还不清楚,推断该基因的功能在脊椎动物,乃至人类的基因功能研究中具有一定借鉴意义.     

鸡新城疫病毒ND-xx08株F基因的克隆及分析

新城疫病毒（NDV）ND-xx08毒株经10 d龄SPF鸡胚增殖后,提取其基因组RNA并反转录成cDNA,用NDV F基因特异性引物,经PCR扩增后获得与F基因预期大小一致的DNA片段。将NDV F基因片段克隆到pMD18-T载体上,并进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示,ND-xx08毒株F基因片段的长度为1 662 bp,共编码554个氨基酸,F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构。将NDV ND-xx08株F基因的47 bp到420 bp序列与新城疫病毒基因型I至基因型Ⅸ毒株的相同序列绘制病毒基因进化树,显示ND-xx08分离株属于基因Ⅶe型。将NDV ND-xx08株F全基因与国内外发表的23株NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,结果表明,其核苷酸序列的同源性在82.7%~97.8%之间,氨基酸同源性在87.5%~97.7%之间。     

痘病毒F10L基因的克隆及生物信息学分析

将古浪山羊痘病毒的基因组DNA提取出来,并设计引物进行PCR扩增,克隆F10L基因的DNA序列.为了分析山羊痘病毒F10蛋白的分子特征,将PCR产物连接到p GEM-T Easy载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对F10L基因序列进行预测分析.结果显示,F10L基因序列由1 335个核苷酸组成的开放阅读框,编码444个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值53.01 ku,理论等电点为7.14.该蛋白的二级结构中,α螺旋占12.44%,β折叠占15.73%,其余71.83%为无规则卷曲.多序列比对分析显示,不同羊痘病毒分离株F10L序列高度保守,一致性在97%以上.此研究结果为进一步研究F10蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础.     

元江普通野生稻金属硫蛋白基因的获得和序列分析

对SMARTTM技术构建的元江普通野生稻叶片cDNA文库进行随机测序,获得了元江普通野生稻的金属硫蛋白基因cDNA序列.该序列全长525 bp,开放阅读框长186 bp,编码62个氨基酸,10个半胱氨酸集中分布在肽链的N端和C端,该蛋白的分子量为6.42 kD,理论等电点为5.21.氨基酸序列(Blastp)同源性分析表明该基因属于金属硫蛋白家族.     

新的人羧肽酶A抑制物cDNA的克隆、定位和表达谱分析

从人的胎脑cDNA文库中,克隆到一条全新的人类羧肽酶A抑制物基因,此cDNA序列全长1049bp,包括翻译起始位点附近的Kozak序列,669bp 的开放读框以及3端的加尾信号,共编码222个氨基酸,它编码的蛋白与小鼠Latexin蛋白和大鼠Latexin蛋白分别有高达85％和84％的同源性,因此命名为人类LATEXIN基因,应用辐射杂交方法,将该基因伫位在人3号染色体3q24区段,位于分子标记D3S1605和D3S1553之间,采用基因芯片杂交的方法研究其在某些组织或细胞中的表达情况,发现在前列腺癌中表达量较高。     

大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的cDNA克隆及序列分析

根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列,对其进行了克隆、测序及分析.结果表明:大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列全长为422bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.45×104,PI为6.81,含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和一个核糖体蛋白S12 signature位点.该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性.     

金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的克隆及其序列特征分析

根据酸性海藻糖酶的蛋白质序列设计引物,PCR扩增出CQMa102 ATM1的cDNA和DNA序列,登录号分别为:DQ237957,EF190950.序列分析表明,ATM1 DNA序列含有3个内含子,其开放阅读框(ORF)编码1个含1 073个氨基酸的蛋白质,具有1个20个氨基酸的信号肽序列和含有30个可能的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr).NCBI序列比对(Blastn)显示该蛋白与Aspergillus fumigatus的alpha、alpha-trehalose glucohydrolase,Aspergillus nidulans的酸性海藻糖酶前体和Talaromyces emrsonii的酸性海藻糖酶分别有62%、59%和57%的氨基酸相似性,与另外两个真菌Saccharomyces cerevisiae(Ath1p)和Candida albi-cans(Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有约25%的氨基酸相似性.Southern杂交表明,ATM1基因在CQMa102基因组中为单拷贝.