实时荧光定量PCR技术检测牙周炎致病菌中16S rRNA DNA探针的制备

利用实时荧光定量PCR和细菌16S rRNA测定技术制备牙龈卟啉菌染色体探针,并进行检测,为进一步研究牙周病可疑致病菌提供方法.主要方法是:厌氧环境下培养牙龈卟啉菌,抽提细菌DNA;根据基因库已知牙龈卟啉菌16S rRNA DNA序列,设计特异性的TaqMan探针和一对引物;经实时荧光定量PCR仪进行细菌DNA样本的PCR反应获得反应曲线.结果表明,细菌DNA样本经PCR反应后,在15个循环时,开始出现扩增曲线,此后荧光逐渐增强,在26个循环后达峰值.由此可见,利用细菌16S rRNA技术制备致病菌染色体探针,经实时荧光定量PCR测定,可以对目标微生物进行准确定性和定量.     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

大黄鱼Hepcidin基因转录物的相对定量分析

以大黄鱼(Pseudosciaena crocea)管家基因18S rRNA和β-actin作为内参基因,分别比较2个内参基因建立的相对定量曲线,最终确立以18S rRNA为参比基因,定量分析大黄鱼的Hepcidin抗菌肽基因.该相对定量分析方法所得结果与Northern-blot方法一致.应用建立的Hepcidin基因的实时荧光相对定量研究方法,对大黄鱼头肾中的Hepcidin基因转录物进行相对定量,为今后开展鱼体内免疫相关基因的表达特性、诱导机制等工作奠定研究基础.同时,克隆得到的大黄鱼β-actin基因和18S rRNA基因片段已提交基因库,并获得登录号.     

新疆玛纳斯河流域抗生素抗性基因的污染分析

抗生素抗性基因(ARGs)是一类新型的环境污染物,可通过基因水平转移在不同的环境介质中传播扩散。本文考察分析了新疆玛纳斯河流域中抗生素抗性基因及耐药菌的污染分布。沿玛纳斯河流域采集了8个表层水样,对四环素类,磺胺类以及大环内脂类三类抗生素耐药菌和七种抗生素抗性基因的含量与分布进行了分析,结果表明:采集的水样对三类抗生素均有耐药性,磺胺类耐药菌的耐药率为85%,其对数值比其他两类高出1.6左右;PCR反应检测ARGs存在情况,除erm A基因外,其它6种ARGs均被检出;荧光定量PCR技术测定ARGs的含量,磺胺类抗性基因(sul1,sul2)的相对丰度较高,均值为3.66×10-3(sul1/16s r RNA)和1.72×10-3(sul2/16s r RNA);水样中各抗性基因的相对表达量sul1sul2erm Btet Wtet Mtet O。上述结果表明,玛纳斯河流域已经受到了ARGs和耐药菌的污染。本研究可以为监测新疆地区水环境中的ARGs提供科学的研究方法,并为流域水污染控制的管理和决策提供科学依据。     

日本鳗鲡嗜水气单胞菌的分离鉴定与免疫相关基因变化的研究

2018年1—2月,饲养于集美大学疫苗中心的日本鳗鲡(Anguilla japonica)出现了一定数量的死亡,从病鱼脾脏中分离到一株优势菌株,结合Biolog系统微生物鉴定和分离菌16S rRNA基因的测序结果,显示该分离菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。采集自然感染嗜水气单胞菌前后的日本鳗鲡肝、脾、肾和粘液为cDNA模板,采用荧光定量PCR(real-time PCR)法检测组织中Toll样受体3(tlr3)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、C型溶菌酶(lysC)和环氧合酶(cox2)等免疫相关基因的表达变化。结果表明:日本鳗鲡自然感染嗜水气单胞菌后,tlr3、tnf-α、cox2均未发现显著性的变化,但lysC的含量在日本鳗鲡脾脏和肾脏中均出现显著性上调,即,自然感染嗜水气单胞菌的日本鳗鲡的抗感染免疫功能与C型溶菌酶密切相关。     

一种定量检测大黄鱼感染变形假单胞菌方法的建立与应用

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)是引起大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要病原。基于变形假单胞菌的gyrB基因与大黄鱼的单拷贝基因gdf-8分别设计1对特异性引物,对所设计的变形假单胞菌gyrB基因的引物特异性进行了检验,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了400尾人工浸泡感染变形假单胞菌5 d后的大黄鱼幼鱼脾脏中的病原菌的相对含量。结果显示,基于gyrB基因所设计的引物对变形假单胞菌检测具有良好的特异性,可以用于对变形假单胞菌的定性和定量检测;400尾人工攻毒大黄鱼幼鱼脾脏中变形假单胞菌的相对含量(相对带菌量,用gyrB基因拷贝数与大黄鱼gdf-8基因拷贝数之比表示)变化在5.04×10~(-7)～0.482之间,不同个体之间的相对带菌量差异很大,说明不同个体的大黄鱼对变形假单胞菌感染的抵抗力有很显著的差异。     

废水处理系统中功能菌株特异分子标记

用40条10碱基随机引物对油脂化工废水处理系统中分离到的降解脂肪酸和脂肪胺功能菌株FA-2。FA-3及对照菌株进行RAPD分析。筛选出长度为700bp的FA-2的特异性片段,并克隆到pMD 18-T载体上．根据测序结果,设计了1对SCAR(sequence characterized anlplfied region)引物,通过SCAR-PCR反应,获得SCAR标记,并通过对20个培养样品进行PCR扩增,验证了标记特异性．结果表明该标记可作为特异的分子标记用于污水处理系统中功能菌株FA-2的监测．     

柑橘小叶病植原体的分子检测及鉴定

对自然表现小叶的柑橘植株,利用植原体16S rRNA基因通用引物进行巢式PCR检测,得到1.2 kb的特异片段,证明此感病植株是由植原体引起.将此特异片段与pGEM-T Easy载体连接并转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,通过PCR鉴定、序列测定及同源性比较分析,结果表明此株系与属于16SrI-B亚组的苜蓿丛枝植原体株系(Lucerne witches′-broom phytoplasma strain,LuWB)同源率达98.88%,故认为该植原体株系属植原体16SrI-B亚组中的成员.     

从业人员预防性健康体检沙门/志贺氏菌检验PCR方法快速筛查的应用

采用实时荧光定量PCR方法快速检测食品等从业人员肠道致病菌,并与培养法进行比较,了解实时荧光定量PCR方法的应用价值.方法:随机采集96 752份从业人员肛拭子标本分别进行实时荧光定量PCR方法和培养法检测沙门氏菌和志贺氏菌,比较两种方法对两种肠道菌的检出率.结果:96 752份标本中,实时荧光定量PCR方法共检测出91份标本沙门氏菌阳性,其中83份分离阳性,41份志贺氏菌阳性,其中30份分离阳性.而传统培养法检测未检出.结论:实时荧光定量PCR方法可以很好的应用在从业人员肠道致病菌的筛查,并且可以提高从业人员肠道致病菌的检出率和准确性,节省劳动力,降低工作人员的工作强度.     

鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

梭鱼和鲻鱼线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段的比较分析

运用PCR技术,扩增了梭鱼和鲻鱼线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段,并比较分析了其种间的序列差异。获得16S rRNA基因的540～560 bp碱基序列,出现26个碱基的插入与缺失位点;获得COⅠ基因的602～604 bp碱基序列,出现2个插入缺失位点;16S rRNA和COⅠ基因的序列中G平均含量最低,且(A+T)含量高于(G+C)含量,与其他鱼类中的16S rRNA和COⅠ基因片段研究结果相一致。在16S rRNA基因片段中,梭鱼出现1种单倍型,鲻鱼为2种单倍型;在COⅠ基因片段中,梭鱼样品中检测到3个单倍型,鲻鱼样品中检测到5个单倍型。以Takifugu poecilonotus为外群,构建的NJ系统发育树,基于16S rRNA和COⅠ基因序列获得的NJ系统树基本一致,鲻鱼和梭鱼种内个体分别聚为一支,显示16S rRNA和COⅠ基因适合于梭鱼和鲻鱼的物种鉴定。     

高粱BTx623幼苗多酚氧化酶Real-time PCR引物扩增效率的检测

介绍了一种检测实时荧光定量PCR技术引物扩增效率的方法,以期为进一步应用实时荧光定量PCR奠定基础。同时通过实时荧光定量PCR技术,研究高粱BTx623幼苗中的多酚氧化酶基因SbPPO的表达情况,结果发现SbPPO2,SbPPO5,SbPPO6的相对表达量较高,这3个SbPPO可能在高粱BTx623幼苗中起到重要功能。     

16S rRNA序列分析在多杀巴斯德氏菌鉴定中的应用

目的应用16s rRNA序列分析方法,对多杀巴斯德氏菌进行鉴定。方法采集猝死家兔样本,进行病理组织学检查和病原菌分离培养。针对细菌16S rRNA基因保守区序列设计一对引物,以分离菌株抽提的DNA为模板,进行PCR扩增及16S rRNA序列分析。结果从死亡家兔肺脏中分离鉴定出了一株多杀巴斯德氏菌(PMr0901)。将分离菌株序列与GenBank中收录的序列进行比较,BLAST分析结果显示PMr0901与多杀巴斯德氏菌参考菌株PM70的16S rRNA核苷酸同源性大于99%。分离菌株对阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、左氧沙星、四环素敏感,而对青霉素G已产生耐药性。结论16s rRNA序列分析的分子生物学方法可用于病原菌的鉴定。     

基于荧光定量PCR的土壤总DNA提取次数研究

探究在不借助其它仪器设备和试剂的条件下,土壤总DNA提取的优化方案。结合荧光定量PCR技术和高通量测序技术对土壤总DNA的提取次数进行研究;发现3次提取的DNA样品的核酸累计量和16S rRNA基因的拷贝数分别占总量的94.84%、85.37%,前4次提取的DNA样品的测序分析结果显示各样品中细菌的相对丰度差异不显著。因此,建议绝对定量分析的实验进行2次以上的DNA提取,定性分析和相对定量分析实验则只需1次提取即可。     

18S rRNA作为植物实时荧光定量PCR内参基因的探究

实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)已广泛用于基因表达分析,而内参基因的选择对qRT-PCR定量分析的数据校正起关键作用.以18S rRNA作为小麦、苜蓿和杜鹃qRT-PCR的内参基因,探究其表达丰度是否适合作为这3种植物的内参基因.结果表明18S rRNA在这3种植物中的表达丰度均过高,Ct值均小于15,影响目的基因定量的准确性.因此,在目的基因的表达量低时,18S rRNA不宜作为这3种植物的内参基因.     

四川黑熊线粒体12S和16S rRNA基因的克隆及序列分析

利用哺乳动物线粒体基因的保守序列设计引物,采用PCR方法,首次从亚洲黑熊四川亚种（Ursus thibetanus mupinensis）的肌肉组织总DNA中扩增出了线粒体12S rRNA和16S rRNA基因并进行了序列测定及分析.结果表明,四川黑熊12S rRNA基因长965 bp;16S rRNA基因长1 580 bp.通过进一步的序列分析表明,四川黑熊的12S rRNA和16S rRNA基因有较高的进化速率,与美洲黑熊、棕熊、北极熊、眼镜熊及大熊猫的相应基因相比较有较大差异,其中与美洲黑熊的同源性相对较高.     

莴苣黄化病植原体的分子鉴定

为了明确新疆莴苣黄花病植原体的分类地位,采用巢式PCR和PCR技术对表现黄化症状的莴苣植株分别利用植原体16S rRNA基因和tuf基因通用引物P1／P7、R16F2n／R16R2和fTufu／rTufu进行扩增,得到大小约1．2kb和0．8kb的特异性片段,对所得片段克隆、测序和序列分析。结果表明：它们分别和榆树黄化组（Elm yellows group）成员的16S rRNA基因、tuf基因同源性最高,分别高于98．6％和92．4％。基于16S rRNA基因和tuf基因的系统进化树分析显示,其均与植原体16Sr V组成员位于同一分支上。对16S rRNA基因的iPhyClassifier分析结果表明,其与榆树黄化组B亚组（16Sr V—B）代表株系JWB（AY197661）具有相同的酶切图谱。所有结果表明莴苣黄化病植原体（LSY）属于榆树黄化组B亚组（16Sr V-B）。     

一株富含类胡萝卜素光合细菌的分离鉴定

从不同生物环境中分离紫色非硫菌,测定其类胡萝卜素含量,筛选出富含类胡萝卜素的菌株.对该菌株的形态学特征、碳氮源利用情况、最适生长pH值及盐度等生物学特征进行研究;利用PCR技术扩增其16S rRNA基因,测序后进行16S rRNA基因序列分析,研究其分类地位.结果:分离自暨南大学明湖底泥的菌株R2,在所分离的8株紫色非硫菌中,类胡萝卜素质量分数最高,为4.83 mg/g(干菌体),该菌株符合红游动菌属(Rhodoplanes)的生物学特性,其最适生长pH为7.0,盐度为0.2%;16S rRNA基因的分子系统学分析表明,该菌株与红游动菌属的Rhodoplanessp.HA17相似性为99.4%.可确定筛选出一株高产类胡萝卜素的菌株,该菌株属于红游动菌属(Rhodoplanes).     

啮齿类实验动物唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光定量PCR方法的建立及应用

目的 建立用于检测实验动物小鼠中唐菖蒲伯克霍尔德菌的荧光定量PCR方法。方法 参考团标公布的序列合成唐菖蒲伯克霍尔德氏菌引物、探针和质粒，建立荧光PCR方法，并对方法的线性、灵敏度、重复性和特异性等性能进行验证。同时应用建立的荧光PCR方法和细菌培养法对110份小鼠送检样品进行比对检测。结果 建立的唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光PCR方法，相关系数R²可达0.998,线性良好；方法最低可检测至1×10² copies/5μL,灵敏度高；方法检测培养的唐菖蒲伯克霍尔德菌为阳性，检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、绿脓杆菌和嗜肺巴斯德杆菌均为阴性，特异性良好。采集110只安乐死小鼠样品，分别进行细菌培养和荧光PCR检测，结果均为阴性，2种方法结果完全符合。结论 建立的荧光PCR方法性能良好，可用于实验动物小鼠唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测。     

盐胁迫下蚕豆不同组织实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出蚕豆盐胁迫下不同组织中表达稳定的内参基因,本研究以不同浓度氯化钠胁迫下的蚕豆叶片、茎、根为材料,利用实时荧光定量PCR技术检测ELF1 A、ACT2、GAPA、18S rRNA、TUA和CYP2六个候选内参基因的表达情况;通过Ct值分析、及GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件综合分析候选...