圆弧青霉突变株HB01碱性脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉(Peniciuium cyclopium)突变株可产生一种具有工业价值的碱性脂肪酶(alkaline lipase,PEL),通过RT-PCR基因克隆及序列测定,获得了PEL完整的基因序列,该基因全长855bp,编码1个由285个氨基酸残基组成的酶蛋白,根据氨基酸组成推导该脂肪酶蛋白的分子量约为30kD.     

扩展青霉碱性脂肪酶的克隆、表达及表达产物的活性分析

以扩展青霉为出发菌株,用Biospin RNA Simply P试剂盒提取其总RNA,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出扩展青霉碱性脂肪酶结构基因.构建真核重组表达质粒pEL-pIC9,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,利用MD-MM平板及PCR方法筛选和鉴定出重组子,进行甲醇诱导表达.重组子发酵液经SDS-PAGE分析显示获得了分子量约28ku的1条特异条带,用橄榄油检验板法和NaOH滴定法测其活性,酶活可达225U/mL.结果表明,扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中能高效表达为有脂肪酶活性的高活力酶.     

肉色曲霉产碱性脂肪酶发酵条件的研究

对肉色曲霉产碱性脂肪酶的发酵条件进行优化,摇瓶实验表明,该菌株最适产酶培养基组成为（%）：黄豆饼粉2,NH4NO3 0.5,玉米粉1,糊精1,柠檬酸钠0.1,K2HPO4 0.5,FeSO4 0.006,大豆油0.6,吐温-800.5mL,pH 9.0.最适产酶温度为28℃,产酶高峰出现在96小时,最佳装液量为35mL,碱性脂肪酶菌株的酶活可达9.3U/mL.脂肪酶的最适作用pH为9.0,最适作用温度为30℃.     

扩展青霉碱性脂肪酶cDNA的克隆和表达

采用TRIzol试剂一步法所抽提的总RNA的D（260）／D（280）值为1.82,甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的28S rRNA和18S rRNA条带。根据扩展青霉所产碱性脂肪酶（Lip PE)N末端20个氨基酸残基序列和真核生物mRNA3‘端具有poly(A)等所提供的生物信息,采用RT－PCR技术和3‘－RACE法扩增了Lip PE成熟肽编码区和3‘非编码区的cDNA,直接将该PCR产物克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明,该碱性脂肪酶含有258个氨基酸,其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用Clot Tech公司的SMART^TM PCR cDNA文库构建试剂盒,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段,从而完成了Lip EP完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,SDS－PAGE检测结果表明,所表达的GST－Lip EP融合蛋白分子质量约为53ku;免疫印迹（Western Blotting)技术证明了所克隆的cDNA确为编码扩展青霉WMC20718脂肪酶的基因。     

碱性脂肪酶产生菌的诱变及产酶条件的研究

微生物脂肪酶 ( E.C.3.1 .1 .3)是一种重要的工业水解酶 ,它可降解甘油三酯为甘油二酯、单甘酯和脂肪酸 [1 ] .碱性脂肪酶是洗涤剂用酶制剂中的一种 ,它可分解衣物上天然污垢中较难除去的甘油三酯 ,提高洗涤剂的去污能力 ,降低表面活性剂和三聚磷酸盐的用量 [2 ] .这里我们报道产碱性脂肪酶菌株的诱变及产酶条件优化等方面的研究结果 .1　材料和方法1 .1　材料1 .1 .1　菌种　芽孢杆菌 O6 2 6 ,筛选自青白江炼油厂的土壤中 .1 .1 .1　培养基　初筛培养基 ( g/L ) :上层　牛肉膏 3,蛋白胨 1 0 ,K2 HPO40 .5 ,Mg SO4.7H2 O0 .5 ,Na NO3…     

扩展青霉碱性脂肪酶的纯化及N-端氨基酸序列分析

扩展青霉PF898的发酵液经硫酸铵沉淀、DE52纤维素离子交换柱、Sephadex G100凝胶过滤等步骤，其碱性脂肪酶的活性被纯化了79．3倍，回收率约15％，此活为76．9U／mg。纯化蛋白经SDS－PAGE和HPLC TSK－GEL G3000SW凝胶过滤分析显示其分子量约为28kDa。纯化蛋白经氨基酸序列测定仪分析表明，其N－端12个氨基酸的序列为：A－T－A－D－A－A－A－F－P－D－L－H。     

响应面试验设计优化脂肪酶发酵培养基

采用响应面试验设计方法对卡门柏青霉（Penicillium camembertii Thom PG3）发酵生产脂肪酶的培养基进行优化。用部分因子分析法研究原始发酵培养基各成分对响应值的影响程度，发现脱脂豆粕和磷酸氢二铵的质量浓度对脂肪酶活性的影响显著。利用最陡爬坡法逼近最大响应区域。用中心组合设计确定脱脂豆粕和磷酸氢二铵的最优质量浓度。实验结果经过回归分析拟合出一个二次方程的数学模型。并且用实验所得的最优培养基进行发酵试验得到的响应值基本符合数学模型。酶活性比优化前提高了43％。     

低温碱性脂肪酶产生菌的筛选及产酶培养基的优化

以橄榄油为唯一碳源,从渤海湾盐碱地被油污染的土样中分离筛选出1株产低温碱性脂肪酶菌株34.5,初步酶学性质研究表明,该菌所产脂肪酶的最适温度为25℃,最适pH为9.6.该菌的16S rDNA基因序列与伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)的同源性为99%.摇瓶实验表明,该菌株最适产酶培养基为(g/L):淀粉10,黄豆饼粉20,玉米浆20,K2HPO41,聚乙烯醇大豆油乳化液20.其最高酶活为6.87 U/mL.     

洗涤剂用碱性脂肪酶稳定剂研究

青霉脂肪酶在一定浓度的钙离子存在下,显示出高的活性,当钙离子浓度为2×10-2M时,酶的相对活性达180%.乙酸钠和多羟基化合物可以作为洗涤剂的稳定剂,其中多羟基高分子化合物对青霉脂肪酶有优良的稳定和激活效果.     

碱性脂肪酶产生菌的筛选与产酶条件及酶学性质研究

作者从泸州油脂厂附近的土壤中,筛选到一株产碱性脂肪酶活性较高的细菌,经初步鉴定为假单胞菌(Pseudomonassp.).经对该菌株进行产酶条件和酶学性质研究发现,该菌株的最适产酶发酵培养基为(%):酵母浸出汁1.5,黄豆粉1,NaCl0.2,K2HPO40.2,NaH2PO40.2,MgSO4·7H2O0.01,初始pH8.5.100mL三角瓶装液10mL,30℃,150r/min摇床培养48h,酶活最高可达19.1U/mL.酶的最适反应温度40℃,最适pH8.5,该酶具有较好的热稳定性.     

扩展青霉脂肪酶的纯化及氨基酸序列测定

扩展青霉（Pen.expansum）WMC20718所产碱性脂肪酶经离心分离、硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析以及凝胶过滤等步骤,其酶纯化了18.5倍,获得了比活性为4200U/mg的纯碱性脂肪酶,提取得率48.8%。纯化后的脂肪酶经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和高效反相色谱（RP-HPLC）检测,分别达到了SDS-PAGE电泳纯和RP-HPLC色谱纯。经SDS-PAGE和Sephadex G-150凝胶过滤色谱,分别测得酶的相对分子质量为27500和28200,表明该酶以单体形式存在。N末端20个氨基酸残基序列测定的结果为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA。该酶的最适作用温度为30℃,在35℃以下稳定,45℃处理30min仅残留30%酶活性;PH稳定范围在6.5-10.5之间,最适PH值为10.0。阴离子表面活性剂LAS对该酶活性的影响较大,而非离子表面活性剂AEO9对酶活性无影响。洗涤剂蛋白酶在规定的添加量范围内,对脂肪酶的活性影响较小。     

碱性脂肪酶产生菌——扩展青霉K40原生质体的制备和 …

采用０．６％纤维素酶加０．６％蜗牛酶的混合酶由扩展青霉Ｋ４０中获得大量的原生质体,并比较了菌龄、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）预处理方式、酶解时间、温度、ｐＨ、培养基成分及稳定剂等因素对原生质体的形成和再生的作用。选出制备原生质体的最适条件：０．６％纤维素酶＋０．６％蜗牛酶,在０．６ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ＋０．３％ＣａＣｌ２,ＤＴＴ预处理０．５ｈ,菌龄为１９～２０ｈ,ｐＨ５．４,２８℃酶解３～３．５ｈ,原生质     

产低温碱性脂肪酶菌株Acinetobacter johnsonii LP28的鉴定及发酵条件优化

从实验室保藏的49株碱性脂肪酶产生菌中筛选出产低温碱性脂肪酶菌株LP28,初步酶学性质研究表明,该脂肪酶的最适作用温度为30℃,最适作用pH为9.0,粗酶液在室温条件下处理48 h仍具有93.78%的残余酶活.该菌经16S rDNA鉴定为约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii),同源性为99%.摇瓶实验表明,该菌株最适产酶培养基为(g/L):淀粉10,牛肉膏20,K2HPO4 1,PVA-大豆油20.最高酶活为3.06 U/m L.     

一株产耐热碱性脂肪酶芽孢杆菌的筛选及其所产酶性质的研究

从武汉市白沙洲沙鸥食用油总厂分离筛选到一株耐热碱性脂肪酶的产生菌,经鉴定为产邪包的短杆菌、革兰氏阳性、该菌株的最适生长温度为４５℃,所产酶的最适作用温度为６０℃,最适ＰＨ为１０．０,且ＰＨ在８．０－１１．０范围内酶蛋白性质稳定。     

扩展青霉脂肪酶的纯化及氨基酸序列测定

扩展青霉 (Pen .expansum)WMC2 0 718所产碱性脂肪酶经离心分离、硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析以及凝胶过滤等步骤 ,其酶纯化了 18.5倍 ,获得了比活性为 4 2 0 0U mg的纯碱性脂肪酶 ,提取得率 4 8.8%。纯化后的脂肪酶经过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和高效反相色谱 (RP HPLC)检测 ,分别达到了SDS PAGE电泳纯和RP HPLC色谱纯。经SDS PAGE和SephadexG 15 0凝胶过滤色谱 ,分别测得酶的相对分子质量为 2 75 0 0和 2 82 0 0 ,表明该酶以单体形式存在。N末端 2 0个氨基酸残基序列测定的结果为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA。该酶的最适作用温度为 30℃ ,在 35℃以下稳定 ,4 5℃处理 30min仅残留 30 %酶活性 ;pH稳定范围在 6 .5～ 10 .5之间 ,最适pH值为 10 .0。阴离子表面活性剂LAS对该酶活性的影响较大 ,而非离子表面活性剂AEO9对酶活性无影响。洗涤剂蛋白酶在规定的添加量范围内 ,对脂肪酶的活性影响较小。     

产碱性脂肪酶酵母菌的分离与鉴定

从成都龙泉果园采集的160份土壤样品中，通过观察油脂平板上水解圈直径与菌落直径的大小之比(D／d)，分离到12株产碱性脂肪酶的真菌，采用滴定法测液体培养物酶活进行复筛，获得一株产酶活性最高的酵母菌，通过对该酵母菌进行形态、生理生化特征的观察与测试，初步鉴定为胶淀粉假丝酵母，命名为Candida amylolenta L-30。     

碱性脂肪酶在正庚烷中催化合成己酸乙酯的研究

用碱性脂肪酶在正庚烷中催化合成己酸乙酯,探讨了加酶量、反应温度和反应时间以及采用不同的碱性脂肪酶等因素对己酸转化率的影响.研究表明,当己酸浓度为0.20 mol/L、己酸和乙醇的摩尔比为1∶1.25、摇床转速为150 r/min、定时加入一定量的3 A分子筛适当移走产物的水分时:最佳反应温度为32℃,产自扩展青霉碱性脂肪酶高产变株FS1884-1的酶A催化效果为最好,当酶A的加入量为每瓶0.30g(相当于950 U/g己酸)、反应时间为24 h时,己酸的转化率已达94%.     

凝结芽胞杆菌产碱性脂肪酶的条件研究

本文对分离获得的产碱性脂肪酶的5株菌进行复筛,对产酶量大的一株菌F12进行鉴定,确定该菌株为凝结芽胞杆菌(BacillusCoagulans)。此菌产碱性脂肪酶的最适条件是:黄豆饼粉2.5,玉米浆1.5,可溶性淀粉0.5,K2HP40.5,NaNO30.5,起始pH9.0,培养温度28～30℃,培养周期22～26h。     

霉菌产脂肪酶发酵条件的研究

从合肥市不同环境的土壤中分离筛选到几株产碱性脂肪酶的霉菌菌株。这些菌株产酶培养基组成 (% )是 :黄豆粉 4 .0 ,玉米浆 1 .0 ,橄榄油 1 .0 ,小麦粉 1 .0 ,(NH4) 2 SO41 .0 ,K2 HPO40 .2 ,pH自然。产酶的最适温度 2 4～ 2 6℃ ,pH稳定范围为 9.4～ 9.5 ,培养周期为 72h .     

扩展青霉FS1884脂肪酶基因的定点诱变及其活性分析

为提高扩展青霉FS1884脂肪酶活性,采用一步突变法对脂肪酶(PEL)的基因进行体外M220V定点诱变,然后将其连接到表达载体pPIC3.5K中, 构建重组表达载体pPIC3.5K-M220V-PEL,电转化毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导后脂肪酶成功分泌表达.重组脂肪酶的活性分析表明:突变体在毕赤酵母中得到活性表达,获得脂肪酶表达产物PEL-M220V-GS,在35 ℃下具有最高酶活为3 099 U/mg, 比野生型提高了5%.