用基因芯片的方法对人酪蛋白激酶CK1γ1基因

将人酪蛋白激酶基因CK1γ1的cDNA与4096个胎脑cDNA一起点在玻璃介质的基因芯片上,用16种不同组织或细胞系的mRNA分别杂交该基因芯片,以正常人混合组织mRNA作共同对照,检测CK1γ1基因的表达谱变化,结果显示人CK1γ1基因在15种组织表达没有变化,但在肝癌组织中的表达却显著下调,采集的7例肝癌标本的cDNA与正常肝组织的cDNA重复7次芯片杂交,结果肯定了CK1γ1基因在肝癌组织中表达下调,同时,对芯片杂交结果通过聚类分析,按基因表达谱特征将CK11基因与其他7种基因聚类在一起,提示CK1r1基因可能在生物学作用方面与这7种基因有某种相关性。     

用基因芯片的方法对人酪蛋白激酶CK1γ1基因进行表达谱和聚类分析

将人酪蛋白激酶基因CK1γ1的cDNA与4096个胎脑cDNA一起点在玻璃介质的基因芯片上,用16种不同组织或细胞系的mRNA分别杂交该基因芯片,以正常人混合组织mRNA作共同对照,检测CK1γ1基因的表达谱变化,结果显示人CK1γ1基因在15种组织表达没有变化,但在肝癌组织中的表达却显著下调.采集的7例肝癌标本的cDNA与正常肝组织的cDNA重复7次芯片杂交,结果肯定了CK1γ1基因在肝癌组织中表达下调.同时,对芯片杂交结果通过聚类分析,按基因表达谱特征将CK1γ1基因与其他7种基因聚类在一起,提示CK1γ1基因可能在生物学作用方面与这7种基因有某种相关性.     

人酪蛋白激酶CK1γ1 cDNA的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

从人胎脑cDNA文库中克隆到一种新的酪蛋白激酶的cDNA，全长1754dp，拟编码438个氨基酸残基，该蛋白预测的分子质量为50272u，等电点9．37，经同源分析，该基因在大鼠的CK1γ1蛋白有94％的相似性，为人1型酪蛋白激酶－γ1亚型基因，人CK1γ1基因同时与15号与17号染色体的基因组部分序列完全一致，但RH法却将基因定位于15q22区段的D15S159－D15S125 Marker之间，多组织Northern膜（MTN）杂交分析显示，人CK1γ1基因在肝，结肠，肾和骨骼肌特别在肝组织中有高表达。     

人超氧化物歧化酶-胸腺素α1融合蛋白在毕赤酵母中的表达与活性检测

为了增强胸腺素α1(Thyα1)的稳定性和免疫功能,采用胸腺素α1与人超氧化物歧化酶(hSOD)融合的策略,构建了6HishSOD-(G4S)1-Thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1 2个融合基因,并分别在毕赤酵母中实现了高水平表达.重组表达的融合蛋白经过Ni-NTA亲和层析纯化后,纯度达到80%以...     

新型雌激素受体ERα36在张氏肝细胞和人肝癌细胞中的表达比较分析

研究新型雌激素受体ERα36在人肝细胞和肝癌细胞系中的差异表达具有重要的意义.以张氏肝(Chang Liv-er)、Caveolin-1基因沉默细胞株CAV7、人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2为实验材料,通过免疫印迹杂交法观察了不同细胞内ERα36蛋白的表达情况,并与典型雌激素受体亚型ERα66蛋白的表达进行了比较.结果发现:(1)几种细胞中均有ERα36蛋白的表达;(2)与张氏肝细胞相比,Caveolin-1基因沉默时ERα36表达明显增加(P0.01);(3)ERα36在SMMC-7721中表达水平较低,而在HepG2细胞中表达水平较高,与ERα66和Caveolin-1的表达水平相关.提示新型雌激素受体ERα36可能参与Caveolin-1介导的雌激素信号转导,而在肝细胞的恶性增殖过程中发挥一定的作用.     

人类T型钙通道α1G和α1H亚单位基因在细胞增殖中的功能

已经发现T型钙通道的表达与细胞增殖关系密切,然而T型钙通道的表达是细胞增殖的原因还是结果有待进一步研究.利用过量表达人类T型钙通道α1G和α1H亚单位基因(CACNA1G和CACNA1H)的HEK-293细胞研究了这两种基因在细胞增殖中的直接作用.通过RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α1G和α1H亚单位基因的过量表达;从生长曲线分析得到了细胞群体倍增时间,HEKα1G 细胞为(13.7±0.3)h,HEKα1H 细胞为(14.0±0.4)h,都短于对照HEK-293细胞的(22.1±1.1)h.流式细胞分析结果表明,在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高,相反地处于G1期的百分率比对照HEK-293细胞低.结果表明,T型钙通道α1G和α1H亚单位基因的过量表达都能显著促进细胞增殖,这一作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制.Western杂交结果提示了T型钙通道的过量表达是通过提高与细胞周期有关的蛋白质(CDK2,cyclin A和cyclin E)的表达水平刺激了细胞周期的进程从而促进细胞增殖.     

八肋游仆虫CK2α-1基因的表达需要+1位编程性翻译移码

酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)在细胞周期,细胞增殖与细胞生长,细胞生存和细胞死亡过程中起着十分重要的作用。为了研究单细胞真核生物中CK2的结构与功能,我们通过分析八肋游仆虫转录组数据得到了七个CK2编码序列,包括四个α亚基和三个β亚基序列。以大核基因组和cDNA为模板对七个基因进行了扩增与鉴定,将其分别命名为EoCK2α-1,EoCK2α-2,EoCK2α-3,EoCK2α-4,EoCK2β-1,EoCK2β-2和EoCK2β-3。序列分析表明EoCK2α-1需要发生+1位的编程性翻译移码,利用在酵母中研究编程性翻译移码的双荧光素酶报告检测体系对EoCK2α-1移码率进行了研究。     

正常脐血TCR Vα亚家族的分布和克隆性表达

目的:了解正常脐血中T细胞受体(TCR)Vα亚家族T细胞的分布和克隆性情况.方法:利用RT-PCR分别扩增10例正常脐血单个核细胞的TCR Vα29个亚家族基因,了解各Vα亚家族的利用情况.阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞的克隆性.9例健康成人外周血和T细胞株Jurkat作为对照.结果:正常脐血T细胞平均表达17.30±5.48个Vα亚家族,占全部家族的59.65%±18.89%,以Vα3,4,5,6,8,10,12,13,15,17,21和Vα25为多见,健康成人外周血T细胞则大部分表达Vα亚家族,Vα1,6和Vα13在脐血中的表达率高于健康成人对照组,而Vα14和Vα16的表达率则低于对照组.T细胞株Jurkat则仅表达Vα1亚家族.基因扫描显示10例脐血中有2例在Vα24和Vα28 T细胞出现寡克隆性,其余均为多克隆性.结论:脐血中TCR Vα亚家族T细胞分布存在倾斜性,绝大部分TCR Vα亚家族T细胞均呈多克隆性,极个别可出现寡克隆性.     

拟南芥蛋白激酶SnRK1α1亚基和α2亚基蛋白纯化

为了构建拟南芥蛋白激酶SnRK1α1基因和SnRK1α2基因的原核表达载体,表达并纯化SnRK1α1和SnRK1α2蛋白,以拟南芥Col-0的cDNA为模板,分别扩增得到SnRK1α1基因和SnRK1α2基因.将其分别构建到含有GST标签的载体PGEX-4T-3上,得到SnRK1α1的原核表达载体GST-SnRK1α1和SnRK1α2的原核表达载体GST-SnRK1α2.菌落PCR扩增鉴定到的阳性克隆测序后,转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析表明,在18℃,0.5mmol/L IPTG诱导条件下,GST-SnRK1α1和GST-SnRK1α1融合蛋白都能够高效、正确的表达.GSTSnRK1α1和GST-SnRK1α2融合蛋白的大小均为84ku.经过GST标签蛋白纯化,得到了纯化的GST-SnRK1α1融合蛋白,为进一步认识SnRK1复杂的三聚体结构以及SnRK1蛋白激酶的理化性质奠定了基础.     

牦牛雌激素受体ERα和ERβ基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异.根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布.结果表明,分别获得2 100 bp ERα(Gen Ban K登录号:KJ011123)和1 791 bp ERβ(Gen Ban K登录号:KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸.多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5%和53.9%-99.1%.荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ.此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低.而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之,心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低.为进一步了解牦牛ERα和ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础.     

人类T型钙通道α1G和α1H亚单位基因在细胞增殖中的功能

已经发现T型钙通道的表达与细胞增殖关系密切，然而T型钙通道的表达是细胞增殖的原因还是结果有待进一步研究．利用过量表达人类T型钙通道α_1G和α_1H亚单位基因 （CACNA1G和CACNA1H） 的HEK-293细胞研究了这两种基因在细胞增殖中的直接作用．通过RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α_1G和α_1H亚单位基因的过量表达；从生长曲线分析得到了细胞群体倍增时间，HEK_α1G ⁺细胞为（13.7±0.3）h，HEK_α1H ⁺细胞为（14.0±0.4）h，都短于对照HEK-293细胞的（22.1±1.1）h.流式细胞分析结果表明，在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高，相反地处于G₁期的百分率比对照HEK-293细胞低．结果表明，T型钙通道α_1G和α_1H亚单位基因的过量表达都能显著促进细胞增殖，这一作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制．Western杂交结果提示了T型钙通道的过量表达是通过提高与细胞周期有关的蛋白质（CDK2，cyclin A和 cyclin E）的表达水平刺激了细胞周期的进程从而促进细胞增殖．     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行Western Blot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.     

胸腺肽α1在毕赤酵母中的表达及纯化

采用基因工程菌发酵制备胸腺肽α1(Tα1).将人工合成的Tα1单体基因,连接到pPIC9K质粒上,构建表达载体pPIC9K-Tα1,转化毕赤酵母GS115,重组菌经甲醇诱导表达,取发酵液上清,过DEAE52、Sephade-xG-25柱纯化后获得目的蛋白.Tricine-SDS-PAGE和HPLC结果表明Tα1基因在毕赤酵母中得以表达,表达量为4.8mg/L.     

胶原Ⅳα1链NC1结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

 胶原中多个成分如ⅩⅤ,ⅩⅤⅢ的NC结构域能抑制血管内皮细胞增殖和迁移,具有抑制肿瘤生长和转移的活性.从胎盘组织中提取总RNA,根据文献报道的胶原Ⅳα₁链cDNA序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出胶原Ⅳα₁链NC1结构域基因.DNA序列测定发现,扩增得到的基因与文献报道序列存在单个核苷酸变异(A132C),编码氨基酸(Gly)不变.将扩增得到的胶原Ⅳα₁链NC1结构域基因克隆到原核表达载体pPROEXHTb上,并在大肠杆菌BL21中进行体外表达.     

新型呼肠病毒S1基因与宿主细胞相互作用的初步研究

摘要 目的 筛选出新型呼肠病毒S1基因和宿主相互作用的关键区段,为后续的宿主受体蛋白筛选工作提供可靠的基础。 方法 将编码全长S1基因,以及N端和C端阅读框分别克隆入真核表达载体pIRSE2-EGFP,转染敏感细胞株鼠成纤维细胞（L929）和人宫颈癌细胞（Hela）后,通过荧光报告基因EGFP的表达分析,筛选出S1基因与宿主细胞相互作用时起决定性影响的区段。 结果 同等量的3种真核表达质粒在单独转染L929时,pGSN质粒转染后荧光表达量最大,pGSC质粒转染后荧光表达量最小。 不同比例混合的pGS与pGSN进行共转染时,pGSN在转染质粒中的比例越高,荧光表达量也越高。 在Hela细胞中的转染结果与L929相同。 结论 新型呼肠病毒R4株的S1基因N端阅读框编码区（62-406bp）在S1基因转染时起关键作用。     

结合利用pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的多拷贝载体并在毕赤酵母中表达

结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的可线性化多拷贝表达载体,并转化毕赤酵母表达目的蛋白.首先将目的蛋白基因构建到组成型表达载体pGAPZαA中,然后依据载体自身特性,用同尾酶BglⅡ和Bam HⅠ切取其表达盒并连接到甲醇诱导型载体pPICZαA中的Bam HⅠ位点处,经多次重复后获得目的蛋白多拷贝表达载体,线性化后电转化毕赤酵母表达目的蛋白.灵芝免疫调节蛋白LZ8是一个已成功在毕赤酵母中表达的蛋白,作为检验该方法的样本其基因被首先构建到载体pGAPZαA中得到质粒pGAPZαA-LZ8,切取其表达盒构建到载体pPICZαA中,经过4次重复得到了多拷贝表达载体pPICZαA-[GAPZαA-LZ8]4,然后利用pPICZαA特有的限制性内切酶位点SacⅠ进行线性化,最终电转化到毕赤酵母GS115中进行组成型表达蛋白LZ8,其表达量达到pGAPZαA-LZ8转化菌株表达量的2~3倍.经检验,结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA可以构建目的蛋白的多拷贝表达载体,并且可以对载体进行线性化而不影响转化酵母时的转化效率.     

MTA1基因在肝癌细胞系HepG_2及其异质性亚系中表达的差异性

目的:探讨MTA1基因在肝癌细胞系HepG2及其异质性亚系中的表达水平.方法:采用半定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR的方法检测3种细胞中MTA1基因的表达差异;Western blotting检测蛋白水平的表达差异;用细胞免疫组织化学方法观察MTA1蛋白的细胞定位.结果:HepG2-H和HepG2细胞株的mRNA和蛋白表达水平均高于HepG2-L细胞株;细胞免疫组化显示3株细胞的MTA1蛋白均定位于细胞核和细胞浆,以细胞核为主.结论:MTA1基因在具有不同转移潜能的肝癌细胞亚系HepG2-H、HepG2-L中的表达具有明显差异.     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

中国流行株HIV—1gp120及其与IFNα基因共表达核酸疫苗质粒的构建及表达

目的 研究pGP和pGPIFNα在真核细胞中的表达。方法 以表达中国流行株HIV－1gp120基因的核酸疫苗质粒pGP及其表达中国流行株HIV－1gp120基因与IFNα基因与IFNα基因的核酸疫苗质粒pGPIFNα。转染BHK－21细胞，以间接免疫荧光鉴定其表达产物。结果 荧光显微镜下，pGP和pGPIFNα转染细胞可见绿色荧光，而HK－21细胞和空质粒则不见绿色荧光。结论 pGP和pGPIFNα可在真核细胞中表达目的蛋白gp120。     

拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究

探讨了拟南芥的翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位.以Col野生型拟南芥的cDNA为模板,通过高保真KOD扩增酶获得2 363bp的拟南芥转录延伸因子EF1A基因片段,将其与GFP融合后共同连入p1300表达载体,利用农杆菌侵染法将p35S∶GFP和p35S∶EF1A∶∶GFP转入野生型拟南芥中,观察转基因植物细胞中GFP的表达情况.结果显示:p35S∶GFP转基因植物中,细胞核中GFP荧光强度显著高于细胞质中荧光强度,但是在p35S∶EF1A∶∶GFP转基因植物中,细胞核中荧光强度与细胞质中荧光强度无显著差异,说明在进行蛋白翻译时细胞质中的EF1A含量显著高于细胞核中,这也为翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位提供了实验依据.