生物素-链霉亲和素系统压电传感实时响应特性研究

生物素与链霉亲和素之间具有高度亲合力和高度特异性,将其用于压电传感研究,反映出了生物素-链霉亲和素系统的压电传感实时响应特性.分别讨论了体系pH对生物素与链霉亲和素吸附行为的影响,链霉亲和素包被浓度、包被时间、结合反应时间等因素对生物素-链霉亲和素结合实验的影响以及结合反应的特征.结果表明,pH=7.4时以100 μg/mL链霉亲和素包被8 h后效果最好;结合反应中,生物素的浓度在0.11～1.65μg/mL范围内,传感器的响应频率值与溶液浓度成线性关系.     

自制核心链霉亲和素的性质

在实验室分离和纯化链霉亲和素的基础上对其性质进行了鉴定．在SDS-PAGE中链霉亲和素只有一条带，单体的分子量为14500Da，链霉亲和素的相对分子量约为58000Da；其等电点为5．9～6．2；结合生物素的活性为15．7U／mg．结果表明自制链霉亲和素为核心链霉亲和素，在纯度、活性等方面达到了理想的效果．     

表面等离子体共振免疫传感的放大检测研究

表面等离子体共振免疫传感器是一类相对新型的免疫检测技术。将链霉亲和素-生物素系统用于表面等离子体共振免疫传感的信号放大,实时检测了人免疫球蛋白G(hIgG)的蛋白浓度。发生免疫反应的传感片和生物素化抗体反应后,传感片表面的一层生物素分子随后与链霉亲和素-生物素化抗体复合物中的链霉亲和素的活性位点发生亲和反应,从而使传感片表面特异健合的物质质量显著增加,大大提高了免疫检测的灵敏度和检测限。免疫反应经放大后,可检测0.005～10μg/mL浓度区间内的hIgG。     

基于小分子末端保护的turn-on传感器构建及其在蛋白质检测中的应用

基于小分子末端保护技术,结合原位合成DNA功能化银簇,构建了一种简单且低成本的蛋白质检测方法。本方法检测链霉亲和素的线性范围为10～1 000 ng/mL,检出限为7. 92 ng/mL,具有较好的选择性并且可以实现复杂样品中目标蛋白质的检测;此外,通过在探针核酸一端修饰上不同的小分子可用于其他相对应蛋白质和细胞的检测,具有良好的通用性;核酸外切酶I的引入,将没有与目标蛋白结合的探针DNA水解为单核苷酸,使之不能形成DNA功能化的银簇,从而降低背景干扰,提高灵敏度;该探针无需修饰荧光染料,且合成银簇所需原料廉价易得,大大节约了成本。     

生物素链霉亲和素联合免疫层析用于快速检测NT-proBNP

为提高常规免疫层析技术的检测灵敏度,引入生物素-链霉亲和素系统,以荧光微球作为标记物,建立了一种新型快速定量检测NT-pro BNP的方法.试验结果表明:新型试剂盒在0.02~30μg·L~(-1)范围能对NT-proBNP实现快速检测.在全血检测中,新型试纸条所测NT-pro BNP浓度与雷度快速免疫分析仪定量检测结果具有很好的一致性.新型免疫层析试纸条大大提高了快速检测的准确性,可广泛用于床旁检验(POCTs)等临床诊断阶段.     

人尿中IgG的时间分辨荧光免疫分析法：以铕标记链亲和素…

利用铕标记链亲和素作为标记物，建立了固相抗体竞争性的人尿中ＩｇＧ的时间分辨荧光免疫分析法，标准曲线范围０．６２５－４０．０ｍｇ．Ｌ。     

玉叶金花(Mussaenda pubescens)SSR引物的快速开发

利用链亲和素磁珠吸附法捕捉能与生物素标记的探针(AC)15退火结合的玉叶金花(Mussaenda pu-bescens)微卫星序列的单链限制性酶切片段.获得的单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEMT载体上,转化至DH5α中,得到一个微卫星序列文库.经测序统计,引物得率为12.5%;根据序列设计的SSR两侧引物PL和PR,共得到5对有多态性的SSR引物.玉叶金花微卫星引物的筛选将为下一步进行玉叶金花基因组结构的分析、分子进化和系统发育研究提供重要的微卫星标记.     

人骨肉瘤细胞适配体的早期筛选

目的体外随机合成单链寡核苷酸备选文库,以骨肉瘤U-2 OS完整细胞作为靶点,筛选出与其结合的高特异性、高亲和性单链DNA(ss DNA).方法将体外合成随机碱基序列的单链DNA文库与人骨肉瘤U-2 OS细胞相结合,收获与靶细胞结合的单链DNA,通过优化PCR条件进行大量扩增后,应用生物素-链霉亲和素亲和层析柱分离出正链DNA.结果以10,14以及18个循环时扩增ds DNA产物最理想;应用生物素-链霉亲和素磁珠分离法制备的正链ss DNA纯度高,可有效保证次级文库的筛选.结论应用Cell-SELEX技术可成功筛选早期ss DNA文库,为后续获得针对人骨肉瘤U-2 OS细胞的高特异性适配体奠定实验基础.     

人尿中IgG的时间分辨荧光免疫分析法──以铕标记链亲和素作为标记物

利用铕标记链亲和素作为标记物，建立了固相抗体竞争性的人尿中ＩｇＧ的时间分辨荧光免疫分析法，标准曲线范围０．６２５～４０．０ｍｇ／Ｌ．检测范围宽，可以用于检测人尿中的ＩｇＧ含量，不用对样品进行稀释，能满足临床检测需要．     

通过二（半胱氨酰）赖氨酸用^99mTc标记生物素

生物素和亲和素具有很强的亲和力，这一特性可以被用于改进放免显像的顶定位技术。本文阐述了利用一种新的含硫含氮配体Ｌ－Ｎ－Ｎ＇－二（半胱氨酰）赖氨酸作为联接剂，用＾９９ｍＴｃ标记生物素的方法，初步研究的结果表明，标记具有较好的体内外稳定性，可以进进一步用于抗肿瘤单抗预定位，再注射能与亲和素结合的放标生物素进行肿瘤显像。     

ApiIa抗菌肽基因的化学合成,克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了ＡｐｉＩａ抗菌肽基因,全长为８０个核苷酸。它被分成４个寡核苷酸片段,分别在ＤＮＡ合成仪上的合成经分离纯化后的寡核苷酸片段经酶促连接,然后被克隆到分泌型载体质粒ｐＡＦＤ１０１上,经限制酶酶切,ＰＣＲ模板检测以及双链ＤＮＡ序列分析检测,证明合成的ａｐｉＩａ基因和设计的完全一致。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

Total synthesis of a human leukocyte interferon gene

A 514-base pair fragment of double-stranded DNA coding for human interferon-alpha 1 (166 amino acid residues), and containing initiation and termination signals plus appropriate restriction enzyme sites for plasmid insertion, has been totally synthesized. The synthesis involved preparation of 66 oligodeoxyribonucleotides, ranging in size from 14 to 21 residues, plus 1 deoxydecanucleotide, by rapid, solid phase procedures, and enzymatic ligation of the oligonucleotides. After ligation of the synthetic gene to a plasmid vector and transformation of Escherichia coli, clones containing the anticipated gene sequence were obtained.     

Rab25基因siRNA表达载体的构建鉴定及在人卵巢癌细胞A2780中的表达

为研究Rab25基因的功能及卵巢癌的基因治疗,构建针对Rab25基因的siRNA表达载体。转染细胞A2780后观察其对Rab25基因表达的抑制作用,为探索卵巢癌基因治疗的新途径打好基础。根据基因库上的Rab25 mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSUPER质粒中,并对重组质粒（命名为pSUPER/Rab25siRNA）进行酶切及序列鉴定,后转染卵巢癌细胞A2780,RT-PCR检测转染前后Ra25的表达情况。双酶切证实RaB25sinRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。RT-PCR检测显示转染卵巢癌细胞A2780后有效抑制了Rab25基因的表达。成功构建Rab25siRNA表达载体,为卵巢癌基因治疗开辟新途径。     

Formation of a stable triplex from a single DNA strand

Homopurine.homopyrimidine DNA sequences have been shown to form triple-stranded structures readily under appropriate conditions. Interest in DNA triplexes arises from potential applications of intermolecular triplexes as antisense inhibitors of gene expression and from the possibility that intramolecular triplexes may have a role in gene expression and recombination. We recently presented NMR evidence for triplex formation from the DNA oligonucleotides d(GA)4 and d(TC)4, which showed unambiguously that the second pyrimidine strand is Hoogsteen base paired and the cytosines are protonated at N3 as required. To obtain a more well defined triplex, and to provide a model for in vivo triplex structures, we have designed and synthesized a 28-base DNA oligomer with a sequence that could potentially fold to form a triplex containing both T.A.T and C+.G.C triplets. Our NMR results indicate that the conformation at pH 5.5 is an intramolecular triplex and that a significant amount of triplex remains even at pH 8.0.     

Self-assembly of two-dimensional DNA crystals

Self-assembly of synthetic oligonucleotides into two-dimensional lattices presents a 慴ottom-up?approach to the fabrication of devices on nanometer scale. We report the design and observation of two-dimensional crystalline forms of DNAs that are composed of twenty-one plane oligonucleo-tides and one phosphate-modified oligonucleotide. These synthetic sequences are designed to self-assemble into four double-crossover (DX) DNA tiles. The 憇ticky ends?of these tiles that associate according to WatsonCrick抯 base pairing are programmed to build up specific periodic patterns upto tens of microns. The patterned crystals are visualized by the transmission electron microscopy.     

Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips

Testing the many hypotheses from genomics and systems biology experiments demands accurate and cost-effective gene and genome synthesis. Here we describe a microchip-based technology for multiplex gene synthesis. Pools of thousands of 'construction' oligonucleotides and tagged complementary 'selection' oligonucleotides are synthesized on photo-programmable microfluidic chips, released, amplified and selected by hybridization to reduce synthesis errors ninefold. A one-step polymerase assembly multiplexing reaction assembles these into multiple genes. This technology enabled us to synthesize all 21 genes that encode the proteins of the Escherichia coli 30S ribosomal subunit, and to optimize their translation efficiency in vitro through alteration of codon bias. This is a significant step towards the synthesis of ribosomes in vitro and should have utility for synthetic biology in general.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.