枯草芽孢杆菌发酵蔗渣生产黄腐酸的工艺条件优化

对实验室筛选的发酵蔗渣产黄腐酸的4株(25B、BT、12、E)细菌进行工厂扩大发酵,并运用分子生物学方法对高产黄腐酸菌种进行鉴定.研究高产菌种的发酵周期、接种量、发酵培养基初始pH以及发酵堆料层等因素对菌种发酵蔗渣产黄腐酸的影响,利用正交实验方法优化发酵培养基的碳源添加与配比.实验结果表明,E菌株为发酵蔗渣高产黄腐酸的菌种,16SrDNA法鉴定结果为枯草芽孢杆菌.该菌种发酵蔗渣高产黄腐酸的最优条件为:接种菌龄24h,接种量0.05L·kg-1,发酵周期4d,发酵物料初始pH4.正交试验优化发酵培养基的主次顺序为蔗渣麸皮蔗糖淀粉.利用优化后的发酵物料培养基与发酵条件进行发酵,获得的黄腐酸含量为23.90%,较工厂发酵模式的对照组(FA含量14.00%)提高9.90%,FA增长率为70.71%.     

L-缬氨酸生产菌的选育及基于遗传算法的发酵培养基优化

采用以黄色短杆菌TV10为出发菌株,经紫外线、硫酸二乙酯逐级诱变处理,在含磺胺胍(SG)、α-氨基丁酸(α-AB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)结构类似物平板上定向筛选,获得L-缬氨酸高产菌株TV230。运用遗传算法,对L-缬氨酸发酵培养基的优化进行了研究,用10组实验完成了8因素20水平的优化任务。实验结果表明,采用优化后的发酵培养基能使缬氨酸的产量提高19.4%。     

纳豆激酶产生菌的固体发酵参数优化

对影响纳豆激酶产生菌固体发酵时产酶影响因子如碳源/氮源、含水量、温度、pH和培养时间等进行了优化.实验结果表明,菌株1适宜的固体发酵产酶培养基豆粕:麸皮比为3∶1;菌株2适宜的固体发酵产酶培养基豆粕:麸皮比为1∶1时产酶活性最高;菌株1适宜的培养基含水以50%最好,菌株2以70%最好;培养基初始pH均在7.0时酶活最高;发酵温度均以25℃最好,不易超过30℃;两个菌株的适宜发酵时间分别为36 h(菌株1)和72 h(菌株2).在优化发酵条件下,两个菌株单位发酵物中纤溶酶平均酶活力可分别达到1 407.25 U/g(菌株1)和953 U/g(菌株2).     

响应曲面法优化重组人神经生长因子发酵培养基组成的研究

通过响应曲面法(RSM)达到优化重组人神经生长因子发酵培养基组分含量的目的.对发酵基础培养基采用四因素三水平实验设计,优化了葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和KH2PO4的最佳浓度,得到了最大预测值并进行了验证.最终优化培养基组分为:葡萄糖7.95 g/L、蛋白胨19.06 g/L、酵母粉13.51 g/L和KH2PO43.87g/L,此时预测最大菌体量Ymax=2.398 g/L.验证试验结果表明:使用优化后的培养基表达重组人神经生长因子,其菌体量的平均值为(2.357±0.083)g/L,实验值与预测值基本相符,均高于优化前菌体量,且其表达量也得到相应提高.     

亚栖热菌产海藻糖合酶培养基的优化

对亚栖热菌CBS-01菌株发酵生产海藻糖合酶的培养基进行了优化.首先通过碳源、氮源实验,选出了适宜的碳、氮源,随后采用Plackett-Burman设计法对培养基中的组分进行了筛选,找出影响产酶的主要因素为蛋白胨和酵母膏,最后利用中心组合设计及响应面分析法求出了主要影响因素的最佳浓度,得到优化的发酵培养基配方(g/L):可溶性淀粉5,蛋白胨8.6,酵母膏1.725,NaNO3 0.7,氨三乙酸0.5,Na2HPO4 0.1,MgSO4·7H2O 0.2,CaCl2 0.1.10 L罐发酵实验表明,CBS-01菌株海藻糖合酶的合成属生长关联型,利用优化的发酵培养基,CBS-01菌株的产酶水平由0.2 U/mL提高到0.41 U/mL.     

Zn2+、Co2+和DMBI对脱氮假单胞杆菌发酵生产VB12的影响

考察了Zn2 、Co2 和DMBI(5,6-二甲基苯并咪唑)对脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)生物合成VB12的影响.结果表明:在发酵培养基中添加一定量的Co2 和DMBI能显著提高VB12的生物合成量,而添加Zn2 能提高发酵液中ALA(δ-氨基乙酰丙酸)和PBG(胆色素原)的合成量,从而促进VB12的合成.在此基础上,利用DPS数据处理系统(Data ProcessingSystem)的二次回归旋转中心组合实验对Zn2 、Co2 和DMBI 3个因素进行优化,确定了ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、DMBI在发酵培养基中的最佳浓度分别为141.11、222.68和77.33 mg/L,经过优化后发酵液中(发酵96 h)VB12的浓度由69.36 mg/L提高到了78.23 mg/L.     

刺糖菌素发酵工艺条件研究

刺糖菌素是由多刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的次级代谢产物,是一种具有触杀及摄食毒性的广谱杀虫剂.通过单因素实验和正交实验对菌株Saccharopolyspora spinosa CT205发酵产刺糖菌素的发酵条件进行了优化.结果表明:该菌产刺糖菌素的发酵培养基添加可溶性淀粉、黄豆饼粉、Na2B4O7和CoCl2可提高刺糖菌素的发酵单位,且得出发酵培养基的初始pH、摇瓶装量和接种量分别以7.0,30 mL/250 mL和10%为最佳.正交实验分析得到最优的发酵培养基为葡萄糖3.0%、可溶性淀粉3.0%、棉籽粉1.0%、黄豆饼粉1.0%、CoCl20.1 mg/L、NaB4 O7 0.1 mg/L.优化之后刺糖菌素的发酵单位达到了90.21μg/mL,比优化前提高了78.5%.     

克雷伯菌HQ-3厌氧发酵产氢培养基的优化

运用Plackett-Burman设计实验结合SAS数据分析对基于克雷伯菌HQ-3(Klebsiellasp.HQ-3)产氢培养基的主效因素进行筛选,确定产氢培养基的主效因素,利用最陡爬坡实验确定主效因素的响应面中心值,用响应面法和Matlab7.0对厌氧发酵的产氢培养基的主效因子进行了优化.得到的优化的产氢培养基(YH培养基)为:Na2HPO4.12H2O,15.0g/L;KH2PO4,7.7g/L;MgSO4.7H2O,3.7g/L;葡萄糖,21.4g/L;蛋白胨,18.1g/L;酵母膏,8.0g/L;pH=8.3.利用优化的培养基进行厌氧发酵产氢验证,得到最大产氢量为826.3mL/L,与预测值806.0mL/L基本相符.并且优化培养基较初始培养基产氢量621.2mL/L,提高了33%.在最优发酵条件下,对发酵液相产物乙醇、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸进行测定,发现乙醇、甲酸、乙酸含量占总液相产物的93%,确定其发酵类型为混合酸途径.     

Fermentation of Bifidobacterium lactis utilizing Tilapia viscera

罗非鱼加工过程中产生大量的下脚料,下脚料中的内脏一般不能被正确处理或高效利用.本研究采用液体发酵工艺,以细菌数为检测指标,以罗非鱼内脏为基本营养发酵乳双歧杆菌Bi07,通过单因素实验和正交实验(L9(34))对其发酵培养基配方和发酵条件进行了优化.优化后的最佳发酵培养基配方为:葡萄糖质量浓度为10 g/L,m料∶m水=1∶7.5,m( NaHCO3)∶m(C3 H7 NO2S·HCI) =4:5,番茄汁体积分数为100 mL/L;最优发酵条件为:发酵时间36 h,发酵温度30℃,接种体积分数5％,初始pH7.0.本研究表明,罗非鱼内脏可以用于乳双歧杆菌的培养基中.     

匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶培养基优化研究

利用响应面法对匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶的培养基进行优化研究.采用单因素实验,得到最佳的碳源、氮源、无机盐.采用Plackett-Burman对影响匍枝根霉产木聚糖酶发酵的相关因素进行评价,确定有显著效应的3个因素.采用最陡爬坡实验确定接近响应值区域显著因素的浓度,利用3因素3水平的Box-Behnken实验进行培养基优化.结果表明,培养基组成:3.9%麦麸玉米芯粉混合碳源,0.35%(NH4)2SO4,0.2%KH2PO4,0.2%MgSO4·7H2O,0.4%CaCl2,0.06%吐温-80,1%微量元素液,装液量为100mL,pH自然,接种量为10%,在30℃,180r/min条件下培养,其木聚糖酶酶活达到最高为101.697U/mL,比优化前木聚糖酶酶活提高了3.5倍.     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

重组大肠杆菌高效表达hbFGF的培养条件

对工程菌hbFGF/BL21(DE3)pLysS高效表达hbFGF的培养条件的研究结果表明，接种量（ψ）为5％，当培养液菌体浓度为0.8OD600时，添加0.5mmol/L诱导剂IPTG可以获得较高的hbFGF表达量，30％的溶解氧和较低的醋酸浓度有利于hbFGF的表达。     

重组人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白的可溶性表达、纯化和对肿瘤细胞的抑制活性

以人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL）为研究对象,根据大肠杆菌密码子偏好性优化,通过基因合成的方法获得重组蛋白核酸序列,连接至pET-24b载体中,并转化入大肠杆菌BL21 (DE3)及BL21 ( DE3) plyS中进行诱导表达。结果显示,在含有2 mg/mL葡萄糖的LB培养基中37 ℃培养至OD-600约为0.6 h,加入0.2 mmol/L IPTG在30 ℃诱导2 h后,重组蛋白可以实现可溶性高表达。工程菌经超声波破碎、高速离心后,经镍柱纯化和脱盐后得到重组蛋白,蛋白纯度达到95 %以上,蛋白最终得率在2.6 mg/g菌体。重组蛋白经IC-50检测,可以较好地抑制肿瘤细胞株的生长。     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

CUEDC2突变体的构建及在原核和昆虫表达系统中的表达

目的：构建CUEDC2的突变体并在原核和昆虫表达系统中表达验证。方法：根据人cuedc2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达,最后用western 进行鉴定。结果：成功构建了CUEDC2的突变体,并在原核和昆虫表达系统中表达。结论：在原核和昆虫表达系统中,成功表达的CUEDC2突变体蛋白为CUEDC2的结构和功能研究奠定了基础。     

集胞藻PCC6803基因sll0853的克隆、优化表达及其结构功能预测

从集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803提取总DNA,利用PCR扩增目的基因sll0853,构建重组T-0853克隆载体和pET-0853原核表达载体.为了提高sll0853在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明sll0853基因蛋白表达的最佳条件.结果表明:目的蛋白在28℃、0.2mmol/L IPTG、诱导6h表达量分别达高峰.通过生物信息学软件预测基因sll0853可能具有裂合酶的功能.     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白7原核表达载体的构建

胰岛素样生长因子结合蛋白7（简称IGFBP7）广泛存在于多种正常的组织中，但在相应的肿瘤细胞中的含量极微。试验表明，它在肿瘤发生的不同阶段抑制其生长。采用RT－PCR和Nest-PCR方法，从正常的小鼠脾脏中扩增得到IGFBP7 cDNA片段，测序正确后，克隆于融合表达载体pRSETC中构建原核表达重组体。     

人血管生成抑制素基因在大肠杆菌中的融合表达

将人血管生成抑制素基因定向插入表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的ＢａｍＨⅠ位点,构建重组质粒ｐＥＴＡ２,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）．在ＩＰＴＧ诱导下,血管生成抑制素基因在重组转化株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＥＴＡ２）中获得高效表达．表达产物以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的３７．２％．利用羊抗人纤溶酶原抗血清作为第一抗体,免疫印迹分析证明表达产物具有特异的免疫原性