人STK11基因启动子区域的克隆

通过生物信息学分析，预测人STK11基因可能的转录起始位点和重要的调控区域.以此为基础，构建含人STK11基因上游序列缺失片段的pGL3重组载体，瞬时转染L-02和HeLa两种细胞系，通过检测荧光素活性分析缺失片段的启动活性.结果显示各缺失片段在两株细胞中均有启动活性；当3′端固定在-918时，5′端由-1943—-1425的移位对启动活性无明显影响，提示这一区间内不存在重要的顺式作用元件；将5′端固定在-1943时，随着3′端向5′的缩短（-918→-1039→-1160），启动活性明显增强（活性pGL3-1943A＞pGL31943B＞pGL3-1943C），提示-1160—-1039和-1039—-918的区间分别存在负性顺式作用元件，同时提示核心启动子的3′端位于-1160的5′末端.在pGL31322（-1322—-918）亦观察到启动活性，提示核心启动子的5′端应该位于-1322的3′末端.因此，人STK11基因的核心启动子位于-1322—-1160之间.     

烟草维管束发育相关基因Nvas启动子顺式作用元件鉴定

为研究烟草维管束发育相关基因Nvas启动子顺式作用元件,将克隆得到的Nvas启动子ATG+1~-463区域分为10个不同长度的片段与GFP报告基因融合构建了植物表达载体并完成了5'端缺失分析.利用根癌农杆菌介导转化W38型烟草叶盘,得到了含有不同长度Nvas启动子片段的转基因烟草植株.体视显微镜下观察到含Nvas启动子-216~-463区域的转基因烟草均有绿色荧光蛋白的表达,表达部位集中在维管束组织.结果表明Nvas启动子能使外源基因在维管束组织中特异表达.该启动子活性高于Ca MV35S,在ATG+1~-216区域存在核心启动子元件,在-337~-379区域存在能增强启动子活性的元件.     

sⅡ系列缺失启动子载体的构建

为检测新型sII根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sII基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段.在启动子片段的5'和3'端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载体pBI121和pBITM2MARⅡ中,取代原有的组成型启动子CaMV35S,获得了四个含有胡萝卜根部特异启动子sII基因不同缺失片段区域与GUS报告基因的融合检测载体.该系列载体通过农杆菌介导转入胡萝卜,检测sII不同长度片段启动子在胡萝卜根部驱动报告基因的表达情况,分析该启动子的功能.     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

人雄激素芳香化酶基因内含子中启动子的研究

利用核酸外切酶Ⅲ（ＥｘｏⅢ）对人雄激素芳香化酶基因的２４００ｂｐ片段的５’端进行系列缺失，并通过转染实验，分析了２４００ｂｐ片段３’端区域的功能作用，在雄激素芳香化酶基因第２外显子的下游区检测到１个具有启动子作用的功能元件，通过序列分析，发现该元件位于雄激素芳香化酶基因的第２内含子中。该启动子同样受到位于雄激素芳香化酶基因第１内含子中沉默因子的抑制作用。该启动子能够启动不同基因的表达，并且具有较强     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

绿色荧光蛋白(GFP)基因在短小芽孢杆菌中的组成型表达

采用PCR技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组中的启动子活性片段F1,构建了一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,检测了该片段在短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段F1具有组成型启动子的功能,GFP基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达．     

麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IPI)启动子的克隆及瞬时表达分析

本文以麻疯树基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到麻疯树异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因(JcIPI)起始密码子上游1 536bp的启动子序列.利用在线软件PLACE和PlantCARE分析表明该序列除具备TATA-Box、CAAT-Box等启动子基本元件外,还含有AuxRR-core、TATC-box、MBS、HSE等特异性元件.为确定启动子核心启动区域,构建JcIPI启动子283、550、970、1 276和1 536bp的5′端缺失片段,并将其分别驱动pBI121载体的葡萄糖苷酸酶(GUS)基因,构建植物表达载体.采用农杆菌介导法转化烟草,在烟草叶片中进行瞬时表达分析.GUS酶活测定结果显示,五个启动子缺失片段都具有启动子活性,并随长度增加而增强.     

氯化钴对人的eNOS基因启动子SP1改构体转录活性的影响

目的:构建改造的人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子,利用氯化钴诱导的人脐静脉血管内皮细胞-12缺氧模型研究其基因启动子活性的变化.方法:用不同剂量的氯化钴体外处理细胞复制缺氧模型,PCR点突变技术构建突变启动子pGL2-eNOS-insSP1,分别将pGL2-eNOS-insSP1和pGL2-eNOS-p载体导入HUVEC-12细胞,双荧光素酶报告基因技术用于检测启动子转录活性的变化.结果:DNA测序显示人的eNOS基因启动子SP1改构体的序列正确;改构体eNOS启动子活性在一定范围内随氯化钴刺激剂量的增加而升高.结论:SP1插入改造的方法显著提高了eNOS基因启动子的转录活性.     

Nodal基因5′末端侧翼序列启动子的分析

为了鉴定Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件,将Ｎｏｄａｌ基因５′侧翼序列的各缺失片段构建以荧光素酶为报告基因的重组质粒。用这些拾报告基因的质粒转化Ｆ９细胞并测定了它们的瞬时表达荧光素酶海性。Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件位于转录起始位点上游约６０ｂｐ,其中含有一个位于－３３ｂｐ处的ＴＡＴＡｂｏｘ,它对于转录起始起着重要作用。这个基本启动子在多种细胞类型中都有活性,但其活性不强。     

苦瓜McAG2启动子的克隆与表达研究

文中从苦瓜基因组中克隆得到长为1417 bp的McAG2基因5′上游片段并进行了DNA序列分析.通过PCR得到了其缺失片段,将其插入pBI121载体替换CaMV35S启动子,得到了McAG2基因5′侧翼缺失表达载体.并利用农杆菌介导转化烟草,建立了相应的转基因烟草植株,以研究其在不同器官组织中的表达特性. β-glucuronidase(GUS)染色结果显示该启动子在转基因烟草叶片和根组织中没有表达活性.     

Klenow大片段聚合酶及T4DNA聚合酶在构建重组质粒中的应用

利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5＇→3＇聚合酶活性和T4DNA聚合酶3＇→5＇外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST.用pUC18-435S中的T35S启动子取代植物表达载体pBLG-VP4-ST中的双35S启动子,通过Klenow大片段的聚合酶活性对植物表达载体pBLG-VP4-ST中的HindⅢ3＇凹端补平,再利用T4DNA聚合酶外切酶活性将质粒pUC18-435S的四倍35S启动子即T35S中的SacⅠ3＇凸端削平.在T4DNA连接酶作用下将一端为平端,另一端为BamHⅠ的粘性末端的四倍35S启动子定向连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中取代原有的双35S启动子,转化并筛选阳性克隆.结果经PCR和酶切鉴定证实,四倍35S启动子成功连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中.     

Pinb基因启动子生物信息学分析及载体构建

运用生物信息学预测并分析小麦硬度基因Pinb的启动子,利用无缝克隆构建胚乳特异表达载体.采用生物信息学软件预测Pinb基因5’端上游调控区3056bp序列进行启动子预测与分析,克隆启动子,利用无缝克隆技术构建Pinb基因的胚乳特异表达的重组质粒,重组质粒经测序鉴定构建正确.Pinb基因5’上游-3060bp至-4bp区域内存在启动子活性,在-2419bp至-500bp间启动子活性分值均在0.8以上,其中-550bp至-500bp区启动子片段分值最高,达到0.99.在-2862bp处和-362bp处各有一个转录起始位点.在-544bp处有一个CAAT盒信号,在-541bp处有一个TATA盒信号.在-2362bp至-2256bp、-1704bp至-1559bp和-537bp至-361bp处各有一个CpG岛.取最有可能的757bp(-803bp至-47bp)启动子片段构建重组质粒(LBLV232),质粒经酶切和测序验证正确.最终,成功构建Pinb基因启动子报告基因表达载体,为系统研究该基因启动子活性提供前期基础.     

P38α对人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响

目的:研究P38α对人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响.方法:利用硝酸还原酶法检测不同浓度氯化钴作用下人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)上清中的一氧化氮(NO)的含量.以pRL-TK为内参照,将已经构建好的pGL2-eNOS-p质粒分别与pGL3-BASIC、pcDNA3、p38a、及p38a(AF)共转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测eNOS基因启动子转录活性,并在共转染的基础上加氯化钴刺激,并检测eNOS基因启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的NO含量随氯化钴作用浓度增加而提高,成功建立化学缺氧模型;p38a在正常和缺氧条件下均明显降低eNOS基因启动子的活性,可被无活性诱变体p38a(AF)逆转.结论:P38et下调人血eNOS基因启动子转录活性.     

水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板利用PCR技术克隆出了对应的5′侧翼序列.经过测序分析,该序列具有许多启动子特征的顺式作用元件,加TA-box,CpG岛等.将这些启动子序列连接到pCAMBIA1391Z双元载体中,构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测.     

GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

目的转录因子GATA-3在人乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色,研究其转录调控有重要意义.方法从人乳腺癌细胞系MCF-7提取基因组DNA为模板,以PCR方法扩增获得GATA-3启动子序列,将片段克隆到pGL3-Basic载体内,鉴定后通过报告基因检测系统检测GATA-3启动子报告基因的荧光素酶活性.结果双酶切、基因测序鉴定结果显示,成功构建了GATA-3启动子报告基因,并在MCF-7细胞内鉴定了其具有荧光素酶的表达活性.结论本实验成功构建了GATA-3启动子报告基因载体pGL3-GATA-3pro-Luc,为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.     

瑞氏木霉木聚糖酶Ⅱ启动子功能区缺失分析的初探

木聚糖酶Ⅱ(Xylanase Ⅱ)是瑞氏木霉中两种主要的内切木聚糖酶之一．序列分析显示其1．1kh的启动子区含有多种丝状真菌转录因子结合位点，可受多种激活因子、抑制因子、增强子的转录调控．以编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的E．coli uidA基因为报告基因，分别与木聚糖酶Ⅱ启动子及功能区(-312～-1080)缺失启动子融合，构建报告质粒pXIIPU与pXIIP△EXU，引入瑞氏木霉蛋白酶缺陷株Trichoderma reesei RutC30U4．先后对转化子进行发酵实验，测定GUS活性。结果显示功能区-312～-1080缺失后的启动子活性是原启动子活性的19％．结果表明在缺失的木聚糖酶Ⅱ启动子-312～-1080区仍存在调节转录活性的顺式作用元件，值得进一步研究．     

Pax5启动子的克隆及其在人淋巴瘤细胞系HL-60中转录因子的确定

克隆Pax5基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性;采用PCR技术从人淋巴瘤细胞系HL-60基因组中扩增出Pax5启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性;测序结果表明扩增的Pax5启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,转录因子SP1和Runx1能以剂量依赖的方式提高Pax5报告基因的转录活性;克隆了Pax5启动子,并发现转录因子SP1和Runx1能够调控Pax5的转录。     

雄激素可调节的肾脏近端肾小管上皮细胞靶向杂合启动子的优化

为研究肾脏雄激素调节蛋白杂合启动子Kap147/HAGT-Kpn的细胞特异性,将HAGT-Kpn片段克隆到pGL3-Kap147载体质粒上,通过细胞转染和荧光素酶活性测定,证实Kap147/HAGT-Kpn杂合启动子只在肾小管上皮细胞来源的OK、LLC-MK2细胞中具有活性,经20nmol/L DHT处理后其活性增加了7~8倍。依据雄激素应答原件的保守性,将不同长度的HAGT-Kpn亚片段克隆到pGL3-Kap147载体质粒上,经20nmol/L DHT处理后,KpnI-StuI和MscI-KpnI两个片段能够使Kap147活性增强1~2倍,由此表明Kap147/HAGT-Kpn杂合启动子依然具有组织细胞特异性且受雄激素调控,KpnI-StuI和MscI-KpnI两个片段承担了雄激素的调控作用。     

环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片…

用大肠杆菌启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达。当用限制酶ＸｂａＩ去除其５’－端１．２ｋｂ片段后，３’－端片段仍能启动Ｋａｎ’基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ，但当１．２ｋｂ片段反向回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ。将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ’ａｄｌｄ